マスト細胞の分泌顆粒の調査。生からのエキソサイトーシスへ
Summary
本プロトコルの目的は、マスト細胞の分泌の機能的ゲノム解析を可能にする方法を開発することであった。プロトコルは、目的の遺伝子とcotrasfected蛍光レポーター遺伝子の放出を定量的に評価し、実時間に基づいて分泌顆粒の形態の分析。
Abstract
マスト細胞（MC）は、予め形成され、新たに合成され、アレルギー性炎症性および免疫メディエーターを放出することによって、それらの生理学的および病理学的機能を達成する免疫系の分泌細胞である。 MCは「メディエーターは、アレルギーおよび免疫応答で最高潮に達する複数の組織や臓器に影響を与える。 MCメディエーターの合成、貯蔵と放出は、高度に規制されています。予め形成されたメディエーターは、原形質膜と融合し、調節性エキソサイトーシスによってそれらの内容物を放出する細胞の分泌顆粒（SG）にパックされている。我々は、のSGに対して標的化された内因性SGメディエーターと一緒に調整された様式で放出されるレポーター遺伝子と目的遺伝子の同時発現に基づくプロトコルを提示する。プロトコルは、4次元の共焦点がMCのSGの解析高分解能を可能にし、トリガエキソサイトーシスに生物発生から自分のタイムラインを監視する。したがって、相互の遺伝子をスクリーニングするためのこのプロトコルを使用して彼らの表現型および機能的な影響のためのESTは、MCのSGの生合成とエキソサイトーシスを支配する分子メカニズムを解読すると、関係規制当局を特定することができます。これにより、健康と病気におけるMCの機能を占める細胞メカニズムへのさらなる洞察が提供されるべきである。
Introduction
マスト細胞（MC）は、最高の、関節炎、喘息、好酸球性食道炎、慢性皮膚炎、およびアナフィラキシーショック1,2-ならびに冠動脈疾患3,5を含む他の病態などのアレルギー及び炎症反応への関与のために知られている免疫細胞であり癌3,4。また、MCは、同種移植片寛容5,6を誘導例えば、細菌および寄生虫に対する宿主防御および免疫応答の抑制の両方によって、先天性および適応免疫において重要な役割を果たしている。
MCは、CD34 + / CD117 +多能性前駆細胞から7を開発し 、骨髄に由来する。コミット骨髄のMC前駆細胞は血流中に放出し、結合組織と上皮表面8内の主にローカライズする末梢組織中に移行されます。成熟と最終分化は、最終的には影響Oの下で達成されている周囲の環境8,9内のFサイトカイン。
MCがその遭遇イムノグロブリンE（IgE）の生成をもたらした抗体を入力アレルゲン（抗原、Ag）などによって活性化することができる。同じAgに対する再曝露の際のIgE細胞結合の架橋に続いてMCのFcεRIの受容体、このようなIgEの結合、FcεRIの凝集および細胞の脱顆粒で最高潮に達しシグナル伝達カスケードの開始の結果は[10,11に総説] 。 MCはまた、活性化された独立してIgEの、神経ペプチド5,12、13、毒素、細菌抗原およびウイルス抗原14,15によって、正に荷電したペプチドの数は、集合的に、基本的な分泌、免疫細胞およびサイトカイン5,13,12,16と称される、17。 MCがさらに炎症反応を増幅する独自のリリースメディエーターの多くによって活性化される。
MCが免疫を含ま分泌顆粒（SGS）が充てんされていそのようなキマーゼおよびトリプターゼ、血管内皮増殖因子およびいくつかのサイトカインおよびケモカイン8,9などのヒスタミン及び（げっ歯類における）セロトニン血管作用性アミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、を含む調節メディエーター。これらのメディエーターは、「行く準備ができて」いるとMCSが適切な刺激によって活性化されると、これらのメディエーターは、分18,19秒のうちに規制エキソサイトーシス（脱顆粒）によって細胞から放出される。この最初のイベントは、アラキドン酸代謝物、複数のサイトカインおよびケモカイン20,21,22を含む生物学的に強力な物質の大きな配列のデノボ合成および放出が続く。新たに合成された製品のリリースは、独立して、SGの放出が原因で発生します。まとめると、これらのメディエーターは、初期および後期相炎症やアレルギー反応を開始する。したがって、MCの活性化と脱顆粒を占めるのメカニズムを理解することは、理論と臨床IMPの両方があるortance。
遺伝的にプライマリおよび培養されたのMCを操作する難しさが不十分な解決のままのMC脱顆粒のメカニズムを解明しようとする試みを、妨げている。我々は、目的の遺伝子と粘膜マスト細胞株、ラット好塩基球性白血病（RBL）-2H3（本明細書でRBLと呼ばれる）、または骨髄由来のMC（BMMCに）30とを共トランスフェクトすることにより、レポーターベースのアッセイを開発し、この問題を克服するために、及びニューロペプチドY（NPY）は、SGのレポーターとして、単量体のRFP（mRFPと）に融合した。
NPYは、以前に、他のシステムにおける内因性SGマーカーの挙動を再現することが示された。 mRFPと蛍光は、pH非感受性であるため、また、NPY-mRFPとの表現は、酸性のSGの可視化を可能にするだけでなく、定量的な96ウェルプレートを用いて、エキソサイトーシスの評価および蛍光プレートリーダー。我々は、NPY-mRFPとはRBL細胞およびBMMCを酸性のSGに送達されることが示されており、細胞から放出される内因性のSG貨物（ すなわち 、βヘキソサミニおよびセロトニン）30、32と並んで、規制の方法で。このプロトコルは、彼らの表現型およびRBL細胞32内のSGの特性や脱顆粒上の機能への影響のために、目的の遺伝子をスクリーニングすることができ、高分解能イメージングベースの方法論を提供しています。具体的には、このプロトコルは、リアルタイムMCのSGのトラッキングとそのエリアまたはボリュームのサイズ、その数、組立体の動力学、細胞骨格に沿ったそれらの動きと異なる条件下で、原形質膜との最終的な融合の定量化を可能にする。例えば、DNP特異的IgEで細胞を感作し、異なる摂動の下で多価のAg（DNP共役血清アルブミン）を用いて細胞を誘発する（ すなわち 、重量または変異遺伝子の過剰発現は、目的の遺伝子のノックダウン、または薬理学的操作）と対照細胞と比較する。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、エキソサイトーシスのためのレポーター遺伝子を用いて、生細胞中でのSGの時間経過の三次元撮像によりMCのエキソサイトーシス及び4の（x、y、zは、t）は、次元定量化の定量化を組み合わせた、革新的な戦略を記載している。この技術は、それらの成熟、エキソサイトーシスの能力と脱顆粒の買収を通じて、早けれゴルジからの出口として開始のSGの監視などのMC機能への影響のため…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、NPY-mRFPとcDNAの贈り物のために博士U. Asheryに感謝。私たちは、博士に感謝。 MJ Kofron、L. Mittleman、M. Shaharbani、およびY. Zilberstein顕微鏡と画像解析との貴重な援助のために。また、この原稿の重要な読書のために博士ジョセフ·オルリーに感謝。この作品は、科学のためのイスラエルアカデミーによって設立されたイスラエル科学財団からの助成金によってサポートされていました（RS-Eに1139年から1112年。）。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
Referências
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