调查肥大细胞分泌颗粒;从合成到胞吐作用
Summary
本议定书的目标是开发一种方法，使肥大细胞分泌功能基因组分析。所述协议是基于荧光报道基因cotrasfected与感兴趣和实时的基因的释放定量评估分析分泌颗粒的形态。
Abstract
肥大细胞（MC）是免疫系统的分泌细胞完成其生理和病理功能通过释放预先形成和新合成的过敏性，炎性和免疫调节介质。 MC的中介影响多个组织和器官最终在过敏和免疫反应。在MC介质的合成，储存和释放受到严格的监管。预形成的介质都装在胞质分泌粒剂（SG），该融合与质膜和由稳压胞吐作用释放其内容。我们提出了一个协议的基础上，共表达的与一个报告基因的兴趣被靶向SGS和被释放的调节的方式沿着内源性SG介质的基因。该协议使高分辨率四维共聚焦分析了MC的SGS和监控，从生源的时间表，以触发胞吐。因此，使用该协议除筛选基因EST他们的表型和功能的影响允许破译支配的MC的SG的生物合成和胞吐作用的分子机制，并确定所涉及的监管机构。由此，进一步的见解认为占在健康和疾病的MC功能的细胞机制应提供。
Introduction
肥大细胞（MC）是最知名的是它们在过敏性和炎性反应，如关节炎，哮喘，嗜酸细胞性食管炎，慢性皮炎和过敏性休克1,2-以及其他疾病，包括冠状动脉疾病3,5-和参与免疫细胞癌症3,4。此外，管委会发挥固有免疫和适应性免疫的重要角色，无论是在对抗细菌和寄生虫的宿主防御和抑制免疫反应，例如诱导移植耐受5,6。
的MC从骨髓来源，来自CD34 + / CD117 +多潜能祖细胞7显影。致力于骨髓祖细胞的MC被释放到血液中，并迁移到结缔组织和上皮表面8内定位主要的外周组织。成熟和终末分化的影响o在最终会实现f显示周围环境8,9内细胞因子。
管委会可通过过敏原（抗原，抗原），其遭遇导致免疫球蛋白E（IgE）的一代型抗体被激活。这样的IgE结合到MC的了FcεRI受体，随后交联的细胞结合的IgE的经重新暴露于相同的银，导致了FcεRI聚集和一个信号级联高潮在细胞脱粒的起始[10,11中综述] 。的MC也被激活，独立的IgE，通过神经肽5,12，毒素13，细菌和病毒抗原14,15，多个带正电荷的肽统称为基本分泌素，免疫细胞和细胞因子5,13,12,16的17。的MC是由许多自身释放介质，其进一步放大炎性反应也被激活。
管委会都挤满了分泌颗粒（SGS）含有免疫调节介质，包括血管活性胺，如组胺和血清素（在啮齿动物），蛋白聚糖，蛋白酶，如胃促胰酶和类胰蛋白酶，血管内皮生长因子和多种细胞因子和趋化因子8,9。这些介质是“准备好”，并一次的MC是由一个适当的刺激物激活，这些介质被从细胞通过在几秒钟到几分钟18,19事项调节胞吐作用（脱粒）释放。这个初始事件之后是从头合成一个大阵列的生物效物质，包括花生四烯酸代谢物，多种细胞因子和趋化因子20,21,22和释放。新合成的产品发布时的独立SG发布。总的来说，这些调解员开展早期和晚期炎症和过敏性反应。因此，了解占MC激活和脱颗粒的机制是理论和临床小鬼ortance。
转基因操纵初级和培养管委会的困难阻碍了试图阐明基本MC脱颗粒的机制，仍然解决不好。为了克服这个问题，我们开发了一种基于记者通过测定共转染的粘膜肥大细胞系，大鼠嗜碱性白血病（RBL）-2H3（本文中称为RBL）或骨髓衍生的MC（的BMMCs）30与感兴趣的基因和神经肽Y（NPY）融合到单体RFP（MRFP），作为SG记者。
NPY先前所示扼要重述在其它系统的内源性SG标志物的行为。此外，由于荧光MRFP是pH值不敏感的，表达NPY-MRFP允许酸性的SG的可视化以及胞吐作用的定量评估通过使用96孔板和荧光板读数器。我们已经表明，NPY-MRFP被输送到RBL细胞和的BMMCs的酸性SGS和从该细胞释放在经调节的方式沿着内源性SG货物（ 即 ，β氨基己糖苷酶和血清素）30，32。这个协议提供了高分辨率成像为基础的方法，它允许对他们的表型和在RBL细胞32上SG上的特点和脱粒功能影响兴趣基因的筛选。具体地，该协议允许的MC的SG的实时跟踪和它们的面积或体积的大小，它们的数量，组装的动力学，其沿着细胞骨架的运动以及它们在不同条件下质膜最终融合的定量。例如，用DNP特异性IgE致敏的细胞和触发细胞用多价抗原（DNP缀合的血清白蛋白）根据不同的扰动（ 即 ，击倒的感兴趣的基因，过的重量或突变基因的表达，或药理学操作），并比较，以控制细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们描述了一种创新的策略，通过时间流逝立体使用报道基因用于胞吐作用在活细胞中的SG成像结合的MC胞吐和4（X，Y，Z，t）的维数的量化值的量化。这项技术使蛋白质他们对MC功能影响的家庭，如监测的SG，早在他们从高尔基通过其成熟的退出，收购胞外分泌能力和脱粒开始筛选。胞吐连同了SGS的形态和动能表征测量相结合，提供了深入了解通过该测试的蛋白介导MC功能的机制。因此，使用这种?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢U.阿瑟瑞博士NPY-MRFP的cDNA的礼物。我们感谢博士。 MJ Kofron，L. Mittleman，M. Shaharbani和Y. Zilberstein与显微镜宝贵援助和图像分析。我们也感谢约瑟夫·奥利博士这个手稿的批判性阅读。这项工作是由以色列科学基金会的资助，由以色列科学院科学支持成立（1139至1112年，以RS-E）。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
Referências
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