मस्तूल सेल स्रावी Granules की जांच कर; जैवसंश्लेषण से exocytosis के लिए
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य मस्तूल सेल स्राव के कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण की अनुमति देगा एक विधि विकसित करने के लिए किया गया था। प्रोटोकॉल ब्याज और वास्तविक समय के जीन के साथ cotrasfected एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन की रिहाई की मात्रात्मक आकलन पर आधारित है स्रावी दाना की आकृति विज्ञान का विश्लेषण करती है।
Abstract
मस्तूल कोशिकाओं (एमसी) का गठन किया-पूर्व और नए संश्लेषित, एलर्जी, सूजन और immunoregulatory मध्यस्थों को रिहा द्वारा अपने शारीरिक और रोग कार्यों को पूरा है कि प्रतिरक्षा प्रणाली के स्रावी कोशिकाओं रहे हैं। MCs के 'मध्यस्थों एलर्जी और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में बनी कई ऊतकों और अंगों को प्रभावित। एम सी मध्यस्थों के संश्लेषण, भंडारण और रिहाई अत्यधिक विनियमित रहे हैं। पूर्व गठित मध्यस्थों प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ्यूज और विनियमित एक्सोसाइटोसिस से अपनी सामग्री को रिहा कि साइटोप्लास्मिक स्रावी कणिकाओं (एसजी) में पैक कर रहे हैं। हम एसजीएस के लिए लक्षित है और अंतर्जात एसजी मध्यस्थों के साथ एक विनियमित फैशन में जारी किया गया है कि एक पत्रकार जीन के साथ ब्याज की एक जीन के सह-अभिव्यक्ति के आधार पर एक प्रोटोकॉल, प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल एम सी एसजीएस का विश्लेषण करती है और ट्रिगर एक्सोसाइटोसिस को जीवजनन से उनके समय की निगरानी उच्च संकल्प चार आयामी confocal सक्षम बनाता है। इस प्रकार, इंटर के जीन स्क्रीनिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोगउनके प्ररूपी और कार्यात्मक प्रभाव के लिए स्था एम सी एसजीएस की जीवजनन और एक्सोसाइटोसिस है कि सरकार आणविक तंत्र का गूढ़ रहस्य और इसमें शामिल नियामकों की पहचान करने की अनुमति देता है। इस प्रकार, स्वास्थ्य और रोग में MCs के समारोह के लिए खाते में है कि सेलुलर तंत्र में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान की जानी चाहिए।
Introduction
मस्तूल कोशिकाओं (एमसी) सर्वश्रेष्ठ जैसे गठिया, दमा, इओसिनोफिलिक ग्रासनलीशोथ, जीर्ण सूजन और कोरोनरी धमनी की बीमारी 3,5 और सहित सदमे 1,2 के साथ ही अन्य विकृतियों के रूप में एलर्जी और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में उनकी भागीदारी के लिए जाना जाता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं कैंसर 3,4। इसके अलावा, एमसीएस allograft सहिष्णुता 5,6 उत्प्रेरण उदाहरण के लिए, बैक्टीरिया और परजीवी के खिलाफ मेजबान बचाव में और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दमन से दोनों, सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
MCs / + CD117 + pluripotent पूर्वज कोशिकाओं 7 CD34 से विकास, अस्थि मज्जा से उत्पन्न। प्रतिबद्ध अस्थि मज्जा एम सी पूर्वज खून में जारी की है और संयोजी ऊतक और उपकला सतहों 8 के भीतर मुख्य रूप से स्थानीयकृत परिधि के ऊतकों में विस्थापित कर रहे हैं। परिपक्वता और टर्मिनल भेदभाव अंततः प्रभाव ओ के तहत प्राप्त कर रहे हैंआसपास के परिवेश 8,9 भीतर च साइटोकिन्स।
MCs जिसका मुठभेड़ इम्युनोग्लोबुलिन ई (आईजीई) की पीढ़ी में हुई एंटीबॉडी टाइप एक allergen (प्रतिजन, एजी) द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। एक ही एजी को फिर से जोखिम पर आईजीई बाध्य सेल के पार से जोड़ने के द्वारा पीछा एम सी के FcεRI रिसेप्टर्स करने के लिए इस तरह के आईजीई का बंधन, FcεRI एकत्रीकरण और सेल degranulation में खत्म है कि एक संकेत झरना की दीक्षा में परिणाम [10,11 में समीक्षा] । MCs के अलावा, neuropeptides 5,12 द्वारा स्वतंत्र रूप से आईजीई का सक्रिय 13, बैक्टीरियल और वायरल एंटीजन 14,15, सामूहिक रूप से बुनियादी secretagogues, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और साइटोकिन्स 5,13,12,16 के रूप में भेजा सकारात्मक आरोप लगाया पेप्टाइड्स के एक नंबर रहे हैं विषाक्त पदार्थों 17। MCs के भी आगे भड़काऊ प्रतिक्रिया बढ़ाना जो अपने खुद के जारी किया मध्यस्थों, के कई द्वारा सक्रिय कर रहे हैं।
MCs के इम्युनो होते हैं कि स्रावी कणिकाओं (एसजीएस) के साथ पैक कर रहे हैंऐसे chymase और tryptase, संवहनी endothelial वृद्धि कारक है और कई साइटोकिन्स और chemokines 8,9 के रूप में इस तरह के हिस्टामिन और (कृन्तकों में) सेरोटोनिन के रूप में vasoactive amines, proteoglycans, प्रोटिएजों, सहित विनियामक मध्यस्थों,। इन मध्यस्थों "जाने के लिए तैयार कर रहे हैं" और MCs के एक उचित प्रोत्साहन से सक्रिय कर रहे हैं, एक बार इन मध्यस्थों मिनट 18,19 सेकंड के एक मामले में विनियमित एक्सोसाइटोसिस (degranulation) द्वारा कोशिकाओं से जारी कर रहे हैं। यह प्रारंभिक घटना arachidonic एसिड चयापचयों, कई साइटोकिन्स और chemokines 20,21,22 सहित जैविक रूप से शक्तिशाली पदार्थ, के एक बड़े सरणी के डी नोवो संश्लेषण और रिहाई के बाद है। नए संश्लेषित उत्पादों की रिहाई के लिए स्वतंत्र रूप एसजी रिहाई के कारण होती है। सामूहिक रूप से, इन मध्यस्थों जल्दी और देर चरण भड़काऊ और एलर्जी प्रतिक्रियाओं का आरंभ। इसलिए, एम सी सक्रियण और degranulation के लिए लेखांकन तंत्र को समझने सैद्धांतिक और नैदानिक छोटा सा भूत की दोनों कर रहे हैंortance।
आनुवंशिक रूप से प्राथमिक और सुसंस्कृत MCs के हेरफेर करने के लिए कठिनाई खराब सुलझाया बना रहा है जो एम सी degranulation अंतर्निहित तंत्र, को स्पष्ट करने का प्रयास बाधा उत्पन्न हो गया है। ब्याज की एक जीन के साथ इस समस्या को दूर करने के लिए हम सह transfecting श्लैष्मिक मस्तूल सेल लाइन, चूहे basophilic ल्यूकेमिया से एक पत्रकार आधारित परख विकसित (आरबीएल) -2H3 (यहाँ आरबीएल के रूप में) या अस्थि मज्जा व्युत्पन्न MCs (BMMCs) 30 और neuropeptide वाई (NPY) एक एसजी पत्रकार के रूप में, मोनोमेरिक आरएफपी (mRFP) से जुड़े हुए।
NPY पहले से अन्य प्रणालियों में अंतर्जात एसजी मार्करों के व्यवहार पुनरावृत्ति को दिखाया गया था। MRFP प्रतिदीप्ति असंवेदनशील पीएच, की अभिव्यक्ति है क्योंकि इसके अलावा, NPY-mRFP 96 अच्छी तरह प्लेटें और एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर का उपयोग करके अम्लीय एसजीएस के दृश्य के साथ ही एक्सोसाइटोसिस की मात्रात्मक आकलन की अनुमति देता है। हम चाहते हैं कि NPY-mRFP आरबीएल कोशिकाओं और BMMCs के अम्लीय एसजीएस को दिया है पता चला है और कोशिकाओं से जारी हैअंतर्जात एसजी कार्गो (यानी, β-hexosaminidase और सेरोटोनिन) 30, 32 के साथ एक विनियमित फैशन में। इस प्रोटोकॉल उनके प्ररूपी और आरबीएल कोशिकाओं 32 में एसजी विशेषताओं और degranulation पर कार्यात्मक प्रभाव के लिए ब्याज की स्क्रीनिंग जीन की अनुमति देता है कि एक उच्च संकल्प इमेजिंग आधारित पद्धति प्रदान करता है। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल वास्तविक समय एमसी एसजीएस की ट्रैकिंग और उनके क्षेत्र या मात्रा आकार, उनकी संख्या, विधानसभा के कैनेटीक्स, सेल cytoskeleton साथ उनके आंदोलन और विभिन्न परिस्थितियों में प्लाज्मा झिल्ली के साथ उनके अंतिम संलयन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, DNP-विशिष्ट IgE के साथ कोशिकाओं को संवेदनशील बनाने और विभिन्न perturbations के तहत एक multivalent एजी (DNP संयुग्मित सीरम albumin) के साथ कोशिकाओं को ट्रिगर (यानी, गुम्मट या उत्परिवर्ती जीन की अभिव्यक्ति है, या औषधीय जोड़तोड़ से अधिक ब्याज की जीन की पछाड़ना,) और कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए की तुलना।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक्सोसाइटोसिस के लिए एक पत्रकार जीन का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं में एसजीएस की समय-व्यपगत तीन आयामी इमेजिंग द्वारा MCs के एक्सोसाइटोसिस और चार (एक्स, वाई, जेड, टी) आयाम quantifications की मात्रा का ठहराव को जोड़ती ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम NPY-mRFP सीडीएनए के उपहार के लिए डॉ यू Ashery धन्यवाद। हम डीआरएस धन्यवाद। एम.जे. Kofron, एल Mittleman, एम Shaharbani, और माइक्रोस्कोपी के साथ अमूल्य सहायता के लिए वाई Zilberstein और छवि विश्लेषण करती है। हम भी इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ यूसुफ ओरली धन्यवाद। इस काम के विज्ञान के लिए इसराइल अकादमी द्वारा स्थापित इसराइल विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (1139-1112 रुपये ई।)।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
Referências
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