Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi
Summary
L'obiettivo del presente protocollo è stato quello di sviluppare un metodo che permetterà analisi di genomica funzionale della secrezione mastociti. Il protocollo si basa sulla valutazione quantitativa del rilascio di un gene reporter fluorescente cotrasfected con il gene di interesse e l'analisi in tempo reale della morfologia del granulo secretorio.
Abstract
Mastociti (MC) sono cellule secretorie del sistema immunitario che svolgono le loro funzioni fisiologiche e patologiche rilasciando mediatori allergici, infiammatorie e immunomodulanti preformati e di nuova sintesi. Mediatori MCs 'riguardano diversi tessuti e organi che culminano nelle risposte allergiche e immunitarie. La sintesi, lo stoccaggio e il rilascio dei mediatori MC sono altamente regolamentati. I mediatori preformati sono confezionati in granuli secretori citoplasmatici (SG), che si fondono con la membrana plasmatica e rilasciano il loro contenuto per esocitosi regolata. Presentiamo un protocollo, basata sulla co-espressione di un gene di interesse con un gene reporter che si rivolge alla SGS e viene rilasciato in modo regolato fianco dei mediatori endogeni SG. Il protocollo consente di alta risoluzione quattro confocale tridimensionale analisi del MC SGS e il controllo della loro linea temporale dal biogenesi a esocitosi innescato. Così, con questo protocollo per lo screening dei geni di Interest per il loro impatto fenotipica e funzionale permette di decifrare i meccanismi molecolari che regolano la biogenesi e esocitosi del MC SGS e identificare i regolatori coinvolti. In tal modo, dovrebbero essere fornite ulteriori informazioni sui meccanismi cellulari che rappresentano la funzione MCs in salute e malattia.
Introduction
Mastociti (MC) sono cellule immunitarie che sono più noti per il loro coinvolgimento nelle reazioni allergiche e infiammatorie come l'artrite, l'asma, esofagite eosinofila, dermatite cronica e shock anafilattico 1,2 così come altre patologie tra cui la malattia coronarica e 3,5 cancro 3,4. Inoltre, MCs svolgono un ruolo importante in innata e adattativa, sia in difesa dell'ospite contro i batteri e parassiti e dalla soppressione delle risposte immunitarie, ad esempio inducendo la tolleranza dell'organo trapiantato 5,6.
MCs provengono dal midollo osseo, lo sviluppo di CD34 + / CD117 + cellule progenitrici pluripotenti 7. Committed midollo osseo MC progenitori vengono rilasciati nel sangue e migrano nei tessuti periferici localizzative prevalentemente all'interno dei tessuti connettivi e superfici epiteliali 8. Maturazione e differenziazione terminale vengono poi raggiunti sotto l'influenza of citochine all'interno l'ambiente circostante 8,9.
MCs possono essere attivati da un allergene (antigene, Ag), il cui incontro portato alla generazione di immunoglobulina E (IgE) tipo anticorpi. Il legame di tale IgE ai recettori FcεRI del MC, seguito da reticolazione di cellula legata IgE upon riesposizione allo stesso Ag, provoca l'aggregazione FcεRI e apertura di una cascata di segnalazione che culmina in degranulazione [recensione in 10,11] . MCs sono attivati, indipendentemente da IgE, da neuropeptidi 5,12, le tossine 13, batterica e antigeni virali 14,15, un numero di peptidi caricati positivamente collettivamente come secretagoghi di base, le cellule immunitarie e citochine 5,13,12,16 , 17. MCs sono anche attivati da molti dei propri mediatori rilasciati, che amplificano ulteriormente la risposta infiammatoria.
MCs sono confezionati con granuli di secreto (SGS) che contengono immunomediatori regolamentari, anche amine vasoattive, come l'istamina e la serotonina (in roditori), proteoglicani, proteasi, come chimasi e triptasi, fattore di crescita vascolare endoteliale e diverse citochine e chemochine 8,9. Questi mediatori sono "pronti a partire" e una volta MCs sono attivati da uno stimolo adeguato, questi mediatori vengono rilasciati dalle cellule di esocitosi regolata (degranulazione) in pochi secondi a minuti 18,19. Questo evento iniziale è seguita dalla sintesi de novo e il rilascio di una vasta gamma di sostanze biologicamente potenti, tra metaboliti dell'acido arachidonico, più citochine e chemochine 20,21,22. Rilascio di prodotti di nuova sintesi si verifica indipendentemente dal rilascio SG. Collettivamente, questi mediatori avviare prime e fase tardiva infiammatori e allergici risposte. Pertanto, la comprensione dei meccanismi che rappresentano per l'attivazione e la degranulazione MC sono entrambi di imp teorica e clinicaortance.
La difficoltà di manipolare geneticamente MCs primarie e coltivate ha ostacolato i tentativi di chiarire i meccanismi alla base MC degranulazione, che è rimasto mal risolti. Per ovviare a questo problema abbiamo sviluppato un giornalista saggio basato da co-trasfezione linea cellulare della mucosa mast, rat leucemia basofili (RBL) -2H3 (di seguito denominato RBL) o di midollo osseo derivate MCs (BMMCs) 30 con un gene di interesse e neuropeptide Y (NPY) fusa RFP monomero (MRFP), come SG giornalista.
NPY è stato precedentemente dimostrato di ricapitolare il comportamento dei marcatori SG endogeni in altri sistemi. Inoltre, perché MRFP fluorescenza è pH insensibile, espressione di NPY-MRFP consente la visualizzazione delle SG acidi e valutazione quantitativa di esocitosi utilizzando piastre da 96 pozzetti e un lettore di fluorescenza. Abbiamo dimostrato che NPY-MRFP viene consegnato al SGS acide delle cellule RBL e BMMCs e viene rilasciato dalle cellulein modo regolato lungo il SG carico endogena (cioè, β-esosaminidasi e serotonina) 30, 32. Questo protocollo fornisce una metodologia di imaging-based ad alta risoluzione che permette di geni di screening di interesse per la loro fenotipica e l'impatto funzionale su caratteristiche SG e degranulazione in cellule RBL 32. In particolare, questo protocollo permette il monitoraggio in tempo reale di MC SGS e quantificazione della loro area o dimensioni del volume, il loro numero, la cinetica di assemblaggio, il loro movimento lungo il citoscheletro cellulare e la loro ultima fusione con la membrana plasmatica in condizioni diverse. Ad esempio, sensibilizzando le cellule con DNP-IgE specifiche e innescando le cellule con un Ag polivalente (DNP coniugato albumina sierica) in diverse perturbazioni (ad esempio, l'abbattimento dei geni di interesse, oltre l'espressione di geni wt o mutanti, o manipolazioni farmacologiche) e confronto alle cellule di controllo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo una strategia innovativa che combina la quantificazione di MCs esocitosi e quattro (x, y, z, t) quantificazioni dimensione da immagini tridimensionali e ritardi delle SG in cellule viventi con un gene reporter per esocitosi. Questa tecnica consente proiezione di famiglie di proteine per il loro impatto sulla funzione MC come SGs monitoraggio inizio già a loro uscita dal Golgi attraverso la loro maturazione, acquisizione di competenze esocitosi e degranulazione. La combinazione di misure di esocitosi i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. U. Ashery per il dono di NPY-MRFP cDNA. Ringraziamo Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, e Y. Zilberstein per la preziosa assistenza di microscopia e analisi dell'immagine. Ringraziamo anche il Dr. Joseph Orly per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Israel Science Foundation, fondata dall'Accademia di Israele per le Scienze (1139-1112 di RS-E.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
Referências
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