Gransker Mast Cell sekresjonsgranuler; fra Biosyntese til eksocytose

Summary

Målet med den foreliggende protokollen var å utvikle en metode som gjør at funksjonelle genomiske analyser av mast celle sekresjon. Protokollen er basert på kvantitativ vurdering av frigivelsen av et fluorescerende reportergen cotrasfected med genet av interesse og sanntids analyse av den sekretoriske granuler sin morfologi.

Abstract

Mastceller (MC) er sekretoriske celler i immunsystemet som oppnår deres fysiologiske og patologiske funksjoner ved å slippe pre-dannet og nylig syntetiserte allergiske, inflammatoriske og immunmediatorer. MCS 'meklere påvirker flere vev og organer som kulminerte i allergiske og immunresponser. Syntese, lagring og frigjøring av MC meklere er sterkt regulert. De forhånds dannet meklere er pakket i cytoplasmatiske sekresjonsgranuler (SG) som blandes med plasmamembranen og slipper sitt innhold av regulerte eksocytose. Vi presenterer en protokoll, basert på co-uttrykket av et gen av interesse med en reporter gen som er målrettet mot SGS og er utgitt i et regulert mote sammen med de endogene SG meklere. Protokollen gir høy oppløsning fire dimensjonale konfokal analyser av MC SGS og overvåke deres tidslinje fra biogenese til utløst eksocytose. Dermed bruker denne protokollen for screening gener av interest for deres fenotypiske og funksjonell innvirkning lar forklaring på de molekylære mekanismene som styrer biogenese og eksocytose av MC SGS og identifisere regulatorer involvert. Dermed bør ytterligere innsikt i de cellulære mekanismene som står for MCs funksjon i helse og sykdom gis.

Introduction

Mastceller (MC) er immunceller som er best kjent for sitt engasjement i allergiske og betennelsesreaksjoner som leddgikt, astma, eosinofil øsofagitt, kronisk eksem og anafylaktisk sjokk ^1,2 samt andre patologier inkludert koronarsykdom ^3,5 og kreft ^3,4. I tillegg MCs spiller viktige roller i medfødt og adaptiv immunitet, både i verts forsvar mot bakterier og parasitter og ved undertrykkelse av immunresponser, for eksempel indusere allograft toleranse ^5,6.

MCs stammer fra benmargen, utvikling fra CD34 + / CD117 + pluripotente stamceller ^7. Forpliktet benmargs MC stamfedre er sluppet ut i blodet og migrere inn i de perifere vev lokalisering hovedsakelig innen bindevev og epiteliale overflater ^8. Modning og terminal differensiering blir til slutt oppnådd under påvirkning of cytokiner innenfor det omkringliggende miljø ^8,9.

MCS kan aktiveres ved et allergen (antigen, Ag), som støter resultert i generering av immunoglobulin E (IgE) type antistoffer. Binding av et slikt IgE til FceRI MC s reseptorer, fulgt av tverrbinding av cellebundet IgE ved re-eksponering av det samme Ag, resulterer i FceRI aggregering og initiering av en signalkaskade som kulminerer i cellen degranulering [gjennomgått i ^10,11] . MCS er også aktiveres uavhengig av IgE, av neuropeptider ^5,12, toksiner ^13, bakterielle og virale antigener ^14,15, et antall positivt ladede peptider kollektivt referert til som basis sekretagoger, immunceller og cytokiner ^{5,13,12,16 , 17.} MCS blir også aktivert ved mange av sine egne frigitte mediatorer, noe som ytterligere forsterker den inflammatoriske respons.

MCs er fullpakket med sekresjonsgranuler (SGS) som inneholder immunregulatoriske mediatorer, inkludert vasoaktive aminer, slik som histamin og serotonin (i gnagere), proteoglykaner, proteaser, slik som chymase og tryptase, vaskulær endotelial vekstfaktor og flere cytokiner og kjemokiner ^8,9. Disse meklere er "klar til å gå" og når MCs aktiveres av en passende stimulus, er disse meklere frigjøres fra celler ved regulert eksocytose (degranulation) i løpet av noen sekunder til minutter ^18,19. Denne første hendelse blir fulgt av de novo syntesen og frigivelse av en stor mengde biologisk potente substanser, inkludert arachidonsyremetabolitter, flere cytokiner og kjemokiner ^20,21,22. Utgivelsen av nye syntetiserte produkter oppstår uavhengig av SG release. Sammen er disse meklere starte tidlig og sen fase inflammatoriske og allergiske reaksjoner. Derfor forstå mekanismene regnskap for MC-aktivering og degranulation er både av teoretisk og klinisk importance.

Vanskelig til genetisk manipulere primære og kultiverte MCs har hemmet forsøkene på å belyse mekanismene bak MC degranulation, som forble dårlig løst. For å overvinne dette problemet vi utviklet en reporter baserte analysen av co-trans slimhinnene mastcellelinje, Rottebasofile leukemi (RBL) -2H3 (heretter omtalt som RBL) eller benmarg avledet MCs (BMMCs) ³⁰ med et gen av interesse og neuropeptid Y (NPY) fusjonert til monomert RFP (mRFP), som en SG reporter.

NPY ble tidligere vist å rekapitulere oppførselen av endogene SG markører i andre systemer. Videre, på grunn mRFP fluorescens er pH-ufølsomt, ekspresjon av NPY-mRFP tillater visualisering av de sure SG samt kvantitativ vurdering av exocytose ved bruk av 96-brønners plater og en fluorescens plateleser. Vi har vist at NPY-mRFP leveres til de sure SGS RBL celler og BMMCs og frigjøres fra cellenei et regulert mote langs den endogene SG last (dvs. β-heksosaminidase og serotonin) ^{30, 32.} Denne protokollen gir en høy oppløsning bildebasert metodikk som gjør at screening gener av interesse for deres fenotypiske og funksjonell innvirkning på SG egenskaper og degranulation i RBL celler ^32. Spesielt, tillater denne protokollen sanntid sporing av MC SG og kvantifisering av sitt område eller volum størrelse, deres antall, kinetikken for montering, deres bevegelse langs cellens cytoskjelett og deres endelige fusjon med plasmamembranen under forskjellige forhold. For eksempel sensibiliserende cellene med DNP-spesifikk IgE og utløser cellene med et flerverdig Ag (DNP konjugert serumalbumin) under forskjellige forstyrrelser (dvs. knockdown av gener som er av interesse, i forhold til ekspresjon av WT eller muterte gener, eller farmakologiske manipulasjoner) og sammenligne å styre celler.

Protocol

1. Utarbeidelse av RBL Cell Culture Media Bland 500 ml lav glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) med 56 ml føtalt bovint serum (dette gjør 10% FBS), og deretter legge til 5,5 ml penicillin streptomycin (dette gjør ~ 1% PEST). Filtrere media ved å bruke 500-1000 ml flaske-Top Vakuum filtre med 0,22 mikrometer porestørrelse og oppbevares ved 4 ° C. 2. Culture of RBL Cells Vokser RBL celler i en fuktet atmosfære av 5% CO2 ved …

Representative Results

På grunn av den lave transfeksjonseffektivitet av MCs, genetiske manipulasjoner er usannsynlig å forlate en innvirkning på avlesninger av gjennomsnittlig sekresjon målt ved endogene SG-meklere. Likevel, ved å etablere en oversikt ko-ekspresjon av reportergenet NPY-mRFP og ko-transfektert plasmid på de samme celler, overvåking av NPY-mRFP resultater i å overvåke utelukkende cellepopulasjonen som uttrykker genet av interesse. Derfor, er fordelen med denne analyse sammenlignet med konvensjonelle metoder evnen til …

Discussion

Vi beskriver en innovativ strategi som kombinerer kvantifisering av MCS exocytose og fire (x, y, z, t) dimensjons kvantifisering av tidsforskjøvede tredimensjonal avbildning av SGS i levende celler ved hjelp av et reporter-gen for exocytose. Denne teknikken gjør at screening av familier av proteiner for deres innvirkning på MC-funksjon som overvåkings SGS begynner så tidlig som sin exit fra Golgi gjennom sin modning, oppkjøp av eksocytose kompetanse og degranulation. Kombinasjonen av målinger av eksocytose sammen…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM	Sigma-Aldrich	D6046-500ML	Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum	GE health care Life sciences	SH30071.01
Penicillin-Streptomycin	Life technologies
Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Corning tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE)	Life technologies	R001100	Warm in 37 °C water bath before use
PIPES dipotassium salt	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Calcium acetate hydrate	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M5661
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)	Sigma-Aldrich	G1501
4 mm electroporation cuvettes	cell projects	EP-104
GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE	Bio rad
Chambered coverglass	Thermo scientific	155411
24 well, flat bottom	Sigma-Aldrich	CLS3524
Corning 96 well plates	Sigma-Aldrich	CLS3367 or CLS390
96 well plate fluorescence reader- Infinite 200	Tecan
Calcium ionophore A23187	Sigma-Aldrich	C7522	Avoid from direct light exposure
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)	Calbiochem	P3766
anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-BSA/ DNP-HAS	Sigma-Aldrich	A6661	Avoid from direct light exposure
Triton-x-100	Sigma-Aldrich	T8787
Confocal fluorescent microscope:
Zeiss LSM 510
Leica	SP5
Nikon A1 inverted
Imaris software	BITLANE
Microsoft exel or Prism or other analyses software
Other reagent:
Magnesium Chloride	MERK	5833
Sodium chloride	MERK	6404
Calcium chloride	MERK	2382
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503
Glucose	BDH Laboratories	284515V
Monosodium phosphate	MERK	5345
Sterile water