Undersöka Mast Cell Sekretorisk Granulat; från Biosyntes till exocytos
Summary
Målet med detta protokoll var att utveckla en metod som gör att funktionsgenomiska analyser av mastcellutsöndring. Protokollet bygger på kvantitativ bedömning av frisläppandet av en fluorescerande reporter gen cotrasfected med genen av intresse och realtidsanalyser av den sekretoriska granulat morfologi.
Abstract
Mastceller (MC) är sekretoriska celler i immunsystemet som utföra deras fysiologiska och patologiska funktioner genom att släppa förformade och nysyntetiserade allergiska, inflammatoriska och immunregulatoriska mediatorer. MCS medlare påverka flera vävnader och organ som kulminerar i allergiska och immunsvar. Syntesen, lagring och frisättning av MC medlarna är starkt reglerad. De förformade mediatorer är förpackade i cytoplasmiska sekretoriska granuler (SG) som smälter med plasmamembranet och frigör deras innehåll genom reglerad exocytos. Vi presenterar ett protokoll, baserat på samtidigt uttryck av en gen av intresse med en reporter gen som är riktad till SGS och släpps i ett reglerat sätt vid sidan av de endogena SG medlare. Protokollet möjliggör hög upplösning fyrdimensionell konfokal analyser av MC SGS och övervaka deras tidslinje från biogenes till utlöst exocytos. Således använder detta protokoll för screening gener av interest för deras fenotypiska och funktionella påverkan tillåter dechiffrera de molekylära mekanismer som styr biogenes och exocytos av MC SGS och identifiera de tillsynsmyndigheter som berörs. Därmed bör ytterligare insikter i de cellulära mekanismer som står för MCs funktion i hälsa och sjukdom lämnas.
Introduction
Mastceller (MC) är immunceller som är mest känd för sin medverkan i allergiska och inflammatoriska reaktioner som artrit, astma, eosinofil esofagit, kronisk dermatit och anafylaktisk chock 1,2 samt andra patologier inklusive kranskärlssjukdom 3,5 och cancer 3,4. Dessutom MCs spelar viktiga roller i medfödda och adaptiva immuniteten, både i värd försvar mot bakterier och parasiter och genom undertryckande av immunsvar, exempelvis inducera allograft tolerans 5,6.
MCs härstammar från benmärgen, utvecklas från CD34 + / CD117 + pluripotenta stamceller 7. Engagerat benmärgs MC gångare släpps ut i blodomloppet och migrera in i de perifera vävnaderna lokalisera främst inom bindväv och epitelytor 8. Mognad och terminal differentiering så småningom uppnås under påverkan of cytokiner inom omgivande miljö 8,9.
MCs kan aktiveras av ett allergen (antigen, Ag), vars möte resulterade i generering av immunoglobulin E (IgE) typ antikroppar. Bindning av sådant IgE till MC: s FceRI receptorer, följt av tvärbindning av cellbundet IgE vid återexponering till samma Ag, resultat i FceRI aggregering och initiering av en signalkaskad som kulminerar i cell degranulering [ses över 10,11] . MCs aktiveras också, oberoende av IgE, genom neuropeptider 5,12, toxiner 13, bakteriella och virala antigener 14,15, ett antal positivt laddade peptider kollektivt kallade grundläggande sekretagoger, immunceller och cytokiner 5,13,12,16 , 17. MCs aktiveras också av många av deras egna frigjorda mediatorer, som ytterligare förstärker det inflammatoriska svaret.
MCs är packade med sekretoriska granuler (SGS) som innehåller immunoregulatoriska mediatorer, däribland vasoaktiva aminer, såsom histamin och serotonin (hos gnagare), proteoglykaner, proteaser, såsom chymas och tryptas, vaskulär endotel tillväxtfaktor och flera cytokiner och kemokiner 8,9. Dessa mediatorer är "redo att gå" och en gång MCs aktiveras genom en lämplig stimulans dessa mediatorer frigörs från cellerna genom reglerat exocytos (degranulering) på några sekunder till minuter 18,19. Denna inledande händelse följs av de novo syntes och frisättning av ett stort utbud av biologiskt potenta substanser, inklusive arakidonsyrametaboliter, flera cytokiner och kemokiner 20,21,22. Release av nyligen syntetiserade produkter sker oberoende av SG release. Tillsammans står dessa mediatorer initierar tidiga och sena fasen inflammatoriska och allergiska reaktioner. Därför att förstå de mekanismer som står för MC aktivering och degranulering är både teoretisk och klinisk importance.
Svårigheten att genetiskt manipulera primära och odlade MCs har försvårat försöken att klarlägga mekanismerna bakom MC degranulering, vilket förblev dåligt lösas. För att lösa detta problem som vi utvecklat en reporter baserad analys av samtransfektera den mucosal mastcellinjen, råtta basofila leukemi (RBL) -2H3 (nedan kallade RBL) eller benmärg härledda MCs (BMMCs) 30 med en gen av intresse och neuropeptid Y (NPY) smält till mono RFP (mRFP), som en SG reporter.
NPY har tidigare visat att rekapitulera beteende endogena SG markörer i andra system. Dessutom, på grund mRFP fluorescens är pH-okänsligt, expression av NPY-mRFP möjliggör visualisering av de sura SGs samt kvantitativ bedömning av exocytos genom att använda 96-brunnars plattor och en fluorescensplattläsare. Vi har visat att NPY-mRFP levereras till de sura SGs av RBL-celler och BMMCs och frisätts från cellernapå ett reglerat sätt vid sidan av endogena SG last (dvs, β-hexosaminidas och serotonin) 30, 32. Protokollet ger en högupplöst bildbaserad metod som gör att screening gener av intresse för deras fenotypiska och funktionella effekter på SG egenskaper och degranulering i RBL celler 32. Specifikt ger detta protokoll realtid spårning av MC SGS och kvantifiering av deras område eller volymstorlek, deras antal, kinetik montering, deras rörelse längs cell cytoskelettet och deras slutliga fusion med plasmamembranet under olika förhållanden. Till exempel, sensibilisering cellerna med DNP-specifikt IgE och utlöser cellerna med en flervärd Ag (DNP konjugerat serumalbumin) under olika störningar (dvs, knockdown av gener av intresse, överuttryck av wt eller mutant gener, eller farmakologiska manipulationer) och jämföra med kontrollceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en innovativ strategi som kombinerar kvantifiering av MCs exocytos och fyra (x, y, z, t) dimensions kvantifieringar av tids förfallit tre-dimensionell avbildning av SGS i levande celler med användning av en reportergen för exocytos. Denna teknik möjliggör screening av familjer av proteiner för deras inverkan på MC-funktion såsom övervaknings SGs börjar så tidigt som deras utträde ur Golgi genom deras mognad, förvärv av exocytos kompetens och degranulering. Kombinationen av mätningar av exocyt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr U. Ashery för gåvan av NPY-mRFP cDNA. Vi tackar Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani och Y. Zilberstein för ovärderlig hjälp med mikroskopi och bildanalyser. Vi tackar även Dr Joseph Orly för kritisk läsning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Israel Science Foundation, som grundades av Israel akademin för Sciences (1139-1112 till RS-E.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
Referências
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells–key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
