형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FPP)
Summary
Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.
Abstract
The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.
Introduction
세포막뿐 아니라 수많은 세포 막은, 수성 두 구획을 분리 장벽의 역할을한다. 세포막의 경우, 분리와 외부 셀의 안쪽이고; 세포 내 소기관 것은 세포질 소기관 루멘 사이이다. 예를 들어, 소포체 (ER) 멤브레인을 저감 한 환경 세포질에서 ER의 루멘 내 산화성 환경을 분리한다. 막 단백질은 ER-관련 리보솜에서 합성하고, ER 막 2 내에서 최종 토폴로지를 얻을 수있다. 단백질에 적합한 막 방향 및 토폴로지의 인수는 정상적인 기능을 위해 중요하다. 정확한 토폴로지가 결합 파트너와 상호 작용하는 세포막 단백질의 중요한 영역을 허용 그것은 중요한 번역 후 변형이 발생할 수 있고, 세포막 단백질의 경우, 세포와 상호 작용하고 t를 응답 할 수환경을 오. 완전히 세포막 단백질의 기능을 이해하려면 그 단백질이 존재하는 막 내, 즉, 그 막 토폴로지에 대해 배향되는 방법을 알고 명백히 필수적이다. 막 단백질은 약리학 타겟 (3)의 대부분을 포함 이후 단백질 표면의 양태는 다른 환경에 노출되는 세포막 단백질 어느의 토폴로지를 이해하는 기초 과학 기술의 취득 이외에 임상 적 의미를 표시하고있다. 최근까지, 시간과 비용에 상당한 투자를 필요거나 구하기 어려운 시약을 요구 한 막 단백질 토폴로지를 결정하는 접근한다.
두 실험과 인 실리코 접근법 세포막 내에 존재하는 단백질의 막 토폴로지를 결정하기 위해 사용되어왔다. INDIVI의 평가에 기초하여 소수성 멤브레인 스패닝 영역의 예측 제 보낸이중 아미노산 3 수많은 예측 알고리즘은 이제 인터넷에서 사용할 수 있으며, 단순히 단백질의 아미노산 서열에 대한 지식을 필요로한다. 그러나 가정은 종종 토폴로지 4,5의 잘못된 할당 될 수 있습니다와 같은 모델링 프로그램, 가정의 중심에 있습니다. 이러한 컴퓨터 기반의 예측이 잠정적으로 막에 걸쳐 영역을 할당 할 수 있지만 또한, 그들은 항상 아미노 또는 단백질의 카르복시 말단이 세포 기관 루멘 또는 셀의 외관, 세포질에 있는지 여부를 확인하지 않습니다. 계산 능력을 증가, 심지어 함께 기계 학습 알고리즘 (6), 이러한 데이터의 사용은 여전히 모델이고, 실험적으로 획득 된 데이터를 이용하여 검증되어야한다. 멤브레인 토폴로지 판정 직접 실험은 면역 반응성을 평가 전과 후에 세포 투과성으로 만들어졌다 단백질 걸쳐 분산 공지 에피토프와 모노클로 날 항체의 패널을 사용하여 수행되었다. 이접근법은 관심있는 단백질을 사용하지 못할 수도 항체들의 세트를 필요로한다.
또 다른 전략은 다시 이전과 막 투과성으로 후 면역 반응의 결정 뒤에 단백질에 걸쳐 다양한 위치에 myc의 또는 헤 마글 루티 닌 (HA)과 같은 에피토프 태그를 엔지니어링하는 것입니다. 면역 원성 태그 이외에, 이러한 시스테인 스캐닝 화학적 변형 (β 갈 락토시다 아제, 알칼리 포스파타제, 또는 β의 마제 포함) 효소 태그는 모든 세포막 단백질 7,8 토폴로지를 결정하기 위해 사용되어왔다. 세포막 단백질의 위상 맵핑 채용 추가적인 방법 에피토프 태그와 약간 다른 접근 방법에 의존한다. 이 방법에서, 태그 서열은 N- 연결 글리코 실화 컨센서스 서열 NXS / T이다. 이러한 시퀀스는 생합성 경로, 내강 대에서 태그의 존재의 루멘에 존재하는 경우에만 발생 글리코 실화 때문에세포질 구획은 쉽게 SDS-PAGE 젤에 질량 변화로 관찰된다. 이러한 접근 방법은 이온 채널 multispanning CFTR 9에인가되었다. 이러한 모든 접근법들이 이용되었지만, 그것들은 모두가 생성 매니 폴드 구조를 서열에 분자 생물학에 상당한 투자를 필요로하는 것이 분명하다.
세포 내 소기관에 위치한 횡단 단백질에 대한 위상 정보를 확인하려면 더 많은 도전 것으로 입증되었습니다. 형광 기반 기술의 적용하지만, 멤브레인 토폴로지 많이 간단의 판정을했다. 이분자 형광 상보의 기술 (BiFC)가 해당 단백질 (10)의 형광 특성을 복원, 형광 단백질의 형광이 아닌 두 단편 사이의 상호 작용에 의존한다. 처음 10 생체 단백질 – 단백질 상호 작용을 결정하기 위해 설명되었지만,이 방법도 이용되고있다식물 세포 (11) 세포막 단백질 토폴로지를 결정한다. 그러나이 방법은 관심의 단백질뿐만 아니라 세포질 또는 세포 내 소기관 루멘 타겟팅 융합 단백질의 다양한 융합 단백질뿐만 아니라 생성을 필요로 시간 집약적이기도 한 관심에있는 세포 내에서는 단백질을 세포막되는 지식이 필요 .
막 단백질의 토폴로지를 결정하는 대안적인 접근법은 단순 12을 설명 하였다. 분석법, 형광 프로테아제 보호 (FPP)는 GFP 및 관심 유전자 간의 융합 단백질의 생성을 필요로한다. 접근법은 GFP 잔기에 비특이적 프로테아제의 상대 접근성에 기반; GFP 여부에 따라 세포 내 소기관의 루멘에 존재하여 단백질 분해로부터 보호 또는 세포질 내에 존재하는 단백질 분해 됨으로써 노출된다. 관심 단백질에 GFP 잔기 세포질을 향하게되면 따라서, 그것은에 노출 될프로테아제 활성 및 형광 신호는 손실. 관심 단백질에 GFP 잔기 (예 골지 내강으로) 환경에서 프로테아제 '보호'을 반대로 향하게되면, 다음 형광 신호는 계속된다.
프로테아제는 세포를 입력 할 수 있지만, 콜레스테롤 결합 토닌 약물이 사용되는 세포 내 세포막 구획을 입력하지 않을. 콜레스테롤은 척추 동물 스테롤 지배적이며, 구체적으로는 세포 내 구획에 대하여 세포막에서 농축된다. 배당체 독소, 디기 토닌은 공장 Digitalis 푸로부터 추출된다. 토닌은 (14, 16) (그림 1) permeabiliztion 선택적 막에 이르게 콜레스테롤이 풍부한 막에 친 화성을 가지고 있습니다. 작은 세포질 성분의 출구 수있을뿐만 아니라, 디기 토닌 또한 투과성으로 단백질 분해 효소 K 또는 트립신과 같은 외인성 분자의 침입을 허용한다. FPP 프로토콜은 FAC 활용세포막은 ER 다른 소기관 반면, 골지체는 엔도 좀이 매우 낮은 콜레스테롤 함량을 가지고 미토콘드리아, 14 그대로 남아, 셀룰러 콜레스테롤 (17)의 80 %까지 포함 t. 세포막에 콜레스테롤의 선택적 혼입 S. 같은 다양한 종에서 진핵 토닌 의존적 세포막 투과성으로의 사용을 허용하는, 많은 진핵 세포에서 관찰되어왔다 인간 (14, 18)에 cerevisiae에. FPP 분석은 (a) 단백질은 막 결합 / 연관 또는 세포질과 세포막 단백질의 (b) 영역에서 자유롭게 확산 여부 세포질 또는 세포 내 소기관 루멘 대향 결정 간단 신속하고 매우 강력한 수단을 제공한다. 막 단백질은 여러 방향이 경우, 신호가 지배적 인 형태에서 발생하고 작은 형태가 감지되지 않습니다. 관심의 단백질 GFP 잔기의 첨가는 그 기능에 영향을 줄 수있는 얼마간의 관심이있을 수있는 반면 및/ 또는 세포 내 현지화,이 실제보다 실제로 더 이론이다. 실제로 많은 연구 명확 태그 GFP 단백질 (19, 20)의 특성을 변화하지 않는다는 것을 보여 주었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
막 단백질의 정확한 방향 및 토폴로지들은 적절한 기능을 위해 필수적이다. 막 단백질 토폴로지 이해의 중요성에도 불구하고, 이러한 데이터가 완전히 결여되는 많은 단백질이있다. FPP는 쉽고 효율적인 세포막 단백질 토폴로지를 결정하는 단계로서, 대부분의 실험실에 의해 수행 될 수있는 하나를 제공한다. FPP 방식은 단백질 토폴로지를 결정하기위한 기존의 방법들에 비해 현저한 장점들을 제?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.
Materials
| Name | Company | Catalgue Number | Comments |
| Digitonin | Calbiochem | 300410 | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Trypsin | Sigma | T3924 | |
| Cav1-GFP | Addgene | 44433 | |
| pAcGFP-1 Golgi | Clontech | 632464 | |
| Polylysine | Sigma | P4707 | |
| Mounting Media | Dako | cS704 |
Referências
- Sevier, C. S., Kaiser, C. A. Formation and transfer of disulphide bonds in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).
- Brodsky, J. L., Skach, W. R. Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems. Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).
- Kyte, J., Doolittle, R. F. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).
- Ott, C. M., Lingappa, V. R. Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict. J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).
- Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins. The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).
- Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method. Protein Eng. 10, 673-676 (1997).
- Geest, M., Lolkema, J. S. Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals. Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).
- Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis. Methods. 36, 148-171 (2005).
- Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion. J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Zamyatnin, A. A., et al. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154 (2006).
- Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization. Nat Methods. 3, 205-210 (2006).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , (1989).
- Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. Do you know the sex of your cells? American journal of physiology. Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).
- Wang, H., Brautigan, D. L. A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2. J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).
- Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2). Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).
- Tagawa, A., et al. Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters. J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).
- Rizzuto, R., et al. A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues. J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Curr Biol. 5, 635-642 (1995).
- Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases. J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).
- Ben-Gedalya, T., et al. Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments. J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).
- Rogers, M., et al. Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system. J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).
- Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER. Traffic. 4, 491-501 (2003).
- Brandee, A. P., et al. Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
