Выделение РНК из клеточных конкретные подгруппы с помощью лазера захвата микродиссекции в сочетании с быстрым иммунноокрашивания
Summary
Анализ экспрессии гена подмножества клеток в определенной ткани представляет собой серьезную проблему. Эта статья описывает, как изолировать высокого качества общей РНК с определенного клеточной популяции путем объединения быстрый способ иммунноокрашивания с лазерным захвата микродиссекции.
Abstract
Лазерная захватывающая микродиссекция (LCM) позволяет изолировать конкретных клеток из тонких срезов тканей с высоким пространственным разрешением. Эффективное LCM требуется точное определение клеток субпопуляций от гетерогенной ткани. Идентификация клеток, представляющих интерес для LCM обычно на основе морфологических критериев или флуоресцентный белок репортеров. Сочетание LCM и быстрого иммунного предлагает альтернативные и эффективные средства для визуализации конкретных типов клеток и изолировать их от окружающих тканей. Высококачественный РНК может затем быть получена из чистого клеточной популяции и дополнительно обрабатываются для последующих применений, в том числе РНК-последовательности, микрочипов или QRT-PCR. Этот подход был ранее выполнен и кратко описаны в нескольких публикациях. Цель этой статьи заключается в иллюстрации того, как выполнять быстрое иммунного клеточной популяции, сохраняя при этом целостность РНК, и, как изолировать эти специфические клетки, используя НОК. Здесь мы проиллюстрируемd такая многоходовая процедура, с помощью иммунного и захвата дофаминергических клеток в ткани головного мозга от одного-дневных мышей. Мы выделяем ключевые важных шагов, которые заслуживают особого внимания. Этот протокол может быть адаптирован для различных тканей и клеток, представляющих интерес. Исследователи из разных областей, скорее всего, выгоду от демонстрации этого подхода.
Introduction
Мозг состоит из большого разнообразия различных типов нейронных сетей, образующих сложные. Эти нейроны организованы в различных группах и подгруппах в зависимости от их морфологии, подключения и экспрессии генов рисунка 1. Развитие микрочипов следующего поколения последовательности, а также Qrt-PCR предлагается возможность сравнить профили экспрессии генов популяций нейронов в различных биологических контекстах 1,2. Эти чувствительные анализы требуют точной идентификации и изоляции клеточных типов, представляющих интерес, сохраняя РНК целостности 2-4. Флуоресцентный активирована сортировки клеток (FACS) методика широко используется для выделения конкретных типов клеток, основанные на клеточной поверхности маркеров и / или морфологии. FACS требует диссоциации клеток шаг до сортировки, что приводит к полной потере пространственным разрешением 5. Многие нейронные субпопуляции отличаются друг от друга в соответствии с их анатомической распределения в гое мозг. Лазерная захвата микродиссекции применяется на тонких срезах мозга обеспечивает подходящий вариант для конкретного изоляции клеток с высоким пространственным разрешением 6-8. Основным недостатком LCM была необходимость идентификации клеток, представляющих интерес, основанные на морфологических критериев или на флуоресцентный белок журналистами генетически модифицированных животных моделях. Разработка новых методов для выполнения быстрых методов иммунноокрашивания, которые сохранили целостность РНК, в сочетании с LCM, теперь позволяет изолировать клеточных субпопуляций, чтобы продолжить генов профилирования экспериментов.
Этот подход был ранее выполнен и кратко описаны в нескольких публикациях 1,9-13. Здесь мы демонстрируем подробную процедуру получения высокого качества РНК с определенного подмножества клеток в комплексной структуры тканей путем объединения быстрый иммунноокрашивания с LCM. Мы покажем, как выполнять основные критические шаги для получения максимального извлечения РНК и избежать деградации РНК, как это может сигственно ген воздействие выражение профилирования.
Для демонстрации этого протокола, дофаминергические нейроны от одного-дневных мозга мыши были направлены. Дофаминергических нейронов может быть immunolabeled с использованием антитела, направленные против тирозингидроксилазы (TH), то фермент, ограничивающий скорость синтеза дофамина. После TH иммуноокрашивания, индивидуальный или группы дофаминергических нейронов может быть выделен с использованием НОК. Микродиссекции клетки собирают в буфере для лизиса, и РНК экстрагировали с использованием набора для выделения РНК. Качество и количество добываемого РНК измеряли с помощью Bioanalyzer 5. Дальнейший анализ экспрессии генов с использованием: РНК последовательности, микрочипов, или Qrt-ПЦР может затем быть выполнена 2,4,6. В качестве примера, в два этапа Qrt-ПЦР показано на лазерных захвачен изолированные дофаминергических доменов. Относительная количественная оценка уровня экспрессии двух дофаминергических генов нейронов маркер показывает селективность этого протокола.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее критическая точка этого метода состоит в том, маркировки клеток, представляющих интерес в то время как предотвращение деградации РНК. Как РНКаз активны в водных растворах, уменьшая время инкубации улучшает сохранение РНК 11,15. Все решения, используемые должны быть обрабо…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
Referências
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson’s Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
