عزل الحمض النووي الريبي من خلية مجموعات سكانية فرعية محددة عن طريق الليزر والتقاط تسليخ مجهري جنبا إلى جنب مع رابيد Immunolabeling
Summary
الجينات تحليل التعبير عن مجموعة فرعية من الخلايا في الأنسجة محددة يمثل تحديا كبيرا. توضح هذه المقالة كيفية عزل الحمض النووي الريبي مجموع عالية الجودة من السكان خلية معينة من خلال الجمع بين طريقة immunolabeling السريع مع ملقط ليزر.
Abstract
ملقط ليزر (LCM) يسمح للعزل خلايا معينة من أقسام الأنسجة رقيقة لقرار مكانية عالية. يتطلب LCM فعال التحديد الدقيق للخلايا القطعان من الأنسجة غير المتجانسة. عادة ما يستند تحديد الخلايا التي تهم LCM على معايير شكلية أو على صحفيين بروتين فلوري. الجمع بين LCM وimmunolabeling السريع يوفر وسيلة بديلة وفعالة لتصور أنواع معينة من الخلايا وعزلهم عن الأنسجة المحيطة. ويمكن بعد ذلك عالية الجودة RNA كنت استخرجت من السكان الخلية نقية ومواصلة تجهيزها لتطبيقات المصب، بما في ذلك RNA-التسلسل، ميكروأري أو QRT-PCR. وقد تم إجراء هذا النهج سابقا ووصف لفترة وجيزة في عدد قليل من المنشورات. والهدف من هذه المقالة هو لتوضيح كيفية تنفيذ immunolabeling السريع لسكان الخلية مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، وكيفية عزل هذه الخلايا محددة باستخدام LCM. هنا، نحن لتوضيحد هذا الإجراء متعددة خطوة immunolabeling والتقاط الخلايا الدوبامين في أنسجة المخ من الفئران عمرها يوم واحد. نسلط الضوء على الخطوات الحاسمة الرئيسية التي تستحق اهتماما خاصا. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لمجموعة متنوعة من الأنسجة والخلايا في المصالح. وسوف يقوم الباحثون من مختلف المجالات من المرجح أن تستفيد من المظاهرة لهذا النهج.
Introduction
يتكون الدماغ من مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا العصبية المختلفة وتشكيل شبكات معقدة. ويتم تنظيم هذه الخلايا العصبية في مجموعات متميزة والمجموعات الفرعية وفقا لمورفولوجيا والاتصال والتعبير الجيني نمطها 1. عرضت تطوير ميكروأرس، الجيل التالي من التسلسل، وQRT-PCR إمكانية للمقارنة ملامح التعبير الجيني للسكان الخلايا العصبية في سياقات البيولوجية المختلفة 1،2. هذه التحليلات حساسة تتطلب التحديد الدقيق وعزل أنواع الخلايا في المصالح مع الحفاظ على سلامة RNA 2-4. تم الفلورسنت تنشيط الخلايا الفرز (FACS) التقنية المستخدمة على نطاق واسع لعزل أنواع معينة من الخلايا على أساس علامات سطح الخلية و / أو التشكل. يتطلب FACS خطوة التفكك الخلية قبل الفرز، مما يؤدي الى فقدان كامل للقرار المكاني 5. العديد من مجموعات سكانية فرعية العصبية تتميز عن بعضها البعض وفقا للتوزيع تشريحي في عشرالبريد الدماغ. ملقط ليزر تطبيقها على أقسام الدماغ رقيقة يوفر خيارا مناسبا لعزل معينة من الخلايا لقرار مكانية عالية 6-8. وكان أحد أوجه القصور الرئيسية لLCM الحاجة إلى تحديد خلايا الفائدة على أساس معايير شكلية أو على صحفيين بروتين فلوري المعدلة وراثيا في النماذج الحيوانية. تطوير تقنيات جديدة لأداء الطرق السريعة التي immunolabeling الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي، بالاشتراك مع LCM، يسمح الآن عزلة المجموعات السكانية الفرعية خلية المضي قدما في تجارب التنميط الجيني.
وقد تم إجراء هذا النهج سابقا ووصف لفترة وجيزة في عدد قليل من المنشورات 1،9-13. هنا، علينا أن نظهر إجراء مفصل للحصول على جودة عالية من الحمض النووي الريبي مجموعة فرعية معينة من الخلايا في بنية النسيج المعقد من خلال الجمع بين immunolabeling سريع مع LCM. وتبين لنا كيفية تنفيذ الخطوات الحاسمة الرئيسية للحصول على الانتعاش RNA القصوى وتجنب تدهور RNA لأنها قد سيجnificantly تأثير الجينات التعبير التنميط.
للمظاهرة من هذا البروتوكول، تم استهداف الخلايا العصبية الدوبامين من المخ الأوسط الماوس عمره يوم واحد. الخلايا العصبية الدوبامين يمكن immunolabeled استخدام أجسام مضادة موجهة ضد هيدروكسيلاز التيروزين (TH)، وإنزيم معدل الحد لتخليق الدوبامين. وبعد المناعية TH، فرد أو مجموعة من الخلايا العصبية الدوبامين ويمكن بعد ذلك تكون معزولة باستخدام LCM. يتم جمع خلايا Microdissected في المخزن المؤقت تحلل، ويتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طقم العزلة RNA. يتم قياس نوعية وكمية الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام bioanalyzer 5. المزيد من التحليل في التعبير الجيني باستخدام: RNA التسلسل، ميكروأري، أو QRT-PCR يمكن بعد ذلك أن يؤديها 2،4،6. وكمثال على ذلك، وأظهرت من خطوتين QRT-PCR على الليزر استولت على المجالات الدوبامين معزولة. الكمي النسبي لمستويات التعبير من اثنين من جينات الخلايا العصبية الدوبامين علامة يوضح الانتقائية من هذا البروتوكول.
Protocol
Representative Results
Discussion
النقطة الأكثر أهمية لهذا الأسلوب تتمثل في وصفها خلايا الفائدة في حين منع تدهور الحمض النووي الريبي. كما RNAses ينشطون في المحاليل المائية، وخفض مرات الحضانة يحسن الحفاظ RNA 11،15. يجب أن يعامل جميع الحلول المستخدمة مع DEPC لتعطيل RNAses. جميع المواد والأسطح تحتاج إلى أن تع…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
Referências
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson’s Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
