RNA Isolasjon fra Cell spesifikke subpopulasjoner Bruke Laser-fangst mikrodisseksjon Kombinert med Rapid Immunolabeling

Summary

Genekspresjon analyse av et undersett av celler i et bestemt vev er en stor utfordring. Denne artikkelen beskriver hvordan du isolerer høy kvalitet total RNA fra en bestemt celle befolkning ved å kombinere en rask immunolabeling metode med laser capture mikrodisseksjon.

Abstract

Laser fangst mikrodisseksjon (LCM) tillater isolering av bestemte celler fra tynne vevssnitt med høy romlig oppløsning. Effektiv LCM krever nøyaktig identifikasjon av celler subpopulasjoner fra et heterogent vev. Identifikasjon av celler av interesse for LCM er vanligvis basert på morfologiske kriterier eller på fluorescerende protein journalister. Kombinasjonen av LCM og hurtig immunolabeling tilbyr en alternativ og effektiv måte for å visualisere spesifikke celletyper, og for å isolere dem fra omgivende vev. Høy kvalitet RNA kan deretter tas ut fra en ren cellepopulasjon og bearbeides videre for nedstrøms applikasjoner, inkludert RNA-sekvensering, microarray eller QRT-PCR. Denne tilnærmingen har tidligere blitt utført og kort beskrevet i noen publikasjoner. Målet med denne artikkelen er å illustrere hvordan du utfører rask immunolabeling av en cellepopulasjon samtidig RNA integritet, og hvordan å isolere disse spesifikke celler ved hjelp LCM. Her, vi illustrered denne multi-trinns prosedyre ved immunolabeling og fange dopaminerge celler i hjernevev fra en-dag-gamle mus. Vi markere viktige kritiske trinn som fortjener spesiell vurdering. Denne protokollen kan tilpasses til en rekke forskjellige vev og celler av interesse. Forskere fra ulike felt vil trolig ha nytte av demonstrasjonen av denne tilnærmingen.

Introduction

Hjernen består av et stort utvalg av forskjellige typer nevroner som danner komplekse nettverk. Disse nevronene er organisert i forskjellige grupper og undergrupper i henhold til deres morfologi, tilkoblingsmuligheter og genuttrykk mønster ^1. Utviklingen av mikromatriser, neste generasjons sekvensering, og QRT-PCR tilbudt muligheten til å sammenligne genekspresjonsprofiler av nevronale populasjoner i ulike biologiske sammenhenger ^1,2. Disse sensitive analyser krever presis identifisering og isolering av celletyper av interesse mens du holder RNA integritet ^2-4. Fluorescerende aktivert cellesortering (FACS) teknikken har blitt mye brukt for å isolere spesifikke celletyper basert på celleoverflatemarkører og / eller morfologi. FACS krever en celle dissosiasjon trinn før sortering, noe som resulterer i et fullstendig tap av romlig oppløsning ^5. Mange neuronal subpopulasjoner skiller seg fra hverandre i henhold til sin anatomiske fordeling i the hjernen. Laser capture mikrodisseksjon brukes på tynne hjerne seksjoner gir et passende alternativ for spesifikke isolering av celler med høy romlig oppløsning ^6-8. En større begrensning av LCM har vært behovet for å identifisere celler av interesse basert på morfologiske kriterier eller fluorescerende protein reportere genetisk konstruert i dyremodeller. Utvikling av nye teknikker for å utføre raske immunolabeling metoder som bevarte RNA integritet, i kombinasjon med LCM, tillater nå isolering av celleunderpopulasjoner for å fortsette med gen-profilering eksperimenter.

Denne tilnærmingen har tidligere blitt utført og kort beskrevet i noen publikasjoner ^1,9-13. Her viser vi en detaljert prosedyre for å oppnå høy kvalitet på RNA fra en spesifikk undergruppe av celler i en kompleks struktur vev ved å kombinere rask immunolabeling med LCM. Vi viser hvordan du utfører viktige kritiske trinn for å oppnå maksimal RNA utvinning og unngå RNA degradering som det kan significantly innvirkning genuttrykk profilering.

For demonstrasjon av denne protokollen, ble dopaminerge nevroner fra en-dags-gamle musehjernen målrettet. Dopaminerge neuroner kan immunolabeled ved hjelp av et antistoff rettet mot tyrosin hydroksylase (TH), det hastighetsbegrensende enzym for dopamin-syntese. Etter TH farging, kan enkeltpersoner eller grupper av dopaminerge nevroner så isoleres ved hjelp av LCM. Microdissected celler er samlet i lyseringsbuffer, og RNA ble ekstrahert ved anvendelse av en RNA-isolering kit. Kvalitet og kvantitet av ekstrahert RNA måles ved hjelp av en Bioanalyzer ^5. Videre analyse av genuttrykk ved bruk av: RNA sekvensering, microarray, eller QRT-PCR kan deretter utføres ^2,4,6. Som et eksempel, er en to-trinns QRT-PCR demonstrert på laser fanget isolert dopaminerge domener. Relativ kvantifisering av uttrykk nivåer av to dopaminerge nevroner markørgener illustrerer selektivitet av denne protokollen.

Protocol

MERK: Forsøkene ble utført i samsvar med den kanadiske Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Université Laval Animal Protection Committee. 1. Prøvepreparering MERK: I dette eksemplet bruker vi mus hjerner på postnatal dag 1. Bruk hypotermi anestesi i knust is i 3 til 4 min for unger, så dissekere hjernen så raskt som mulig i iskaldt L15 medium. Utføre dette trinnet innen 2 min. Overfør dissekert hjerner i embedd…

Representative Results

Denne raske immunolabeling fremgangsmåte tillater visualisering av celler av interesse, samtidig som RNA integritet. Figur 1 illustrerer de trinn vevspreparat før RNA-ekstrahering. Etter cryosectioning, er dopaminerge neuroner merket ved anvendelse av et antistoff rettet mot tyrosinhydroksylase (merkede nevroner vises i brun). Avhengig av den eksperimentelle spørsmålet kan enkle celler eller større område av interesse bli isolert ved hjelp av LCM (figur 1D – E). D…

Discussion

Den mest kritiske punkt ved denne metode består i merking av celler av interesse, mens hindrer RNA-degradering. Som RNaser er aktive i vandige oppløsninger, mink inkubasjonstider forbedrer RNA bevaring ^11,15. Alle løsninger som brukes må behandles med DEPC å inaktivere RNases. Alle materialer og overflater trenger å bli behandlet med et overflate RNAse dekontaminering løsning for å hindre forurensning RNaser. Til slutt, i disse forhold, er tilsetning av RNAse inhibitoren i alle løsningene effektive i…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Membrane coated slides	Leica Biosystems	11505158	MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs
Surface RNAse decontamination solution	Life technologies	AM9780	RNaseZap
Fixative			70% Ethanol kept at -20 °C
Anti-TH	Pel-Freez	P40101	1:25
RNAse free buffer			DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton
RNAse inhibitor	Promega	N2615	Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock)
Anti-rabbit biotinylated	Vector Laboratories	BA-1000
Vectastain Elite ABC kit Standard	Vector Laboratories	PK-6100	8µl/ml
DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4100
RNA isolation kit	Life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
H2O2 30%	Sigma	HC4060
Ethanol absolute
Laser microdissection system	Leica microsystems		Model AS-LMD
DEPC	Alfa Aesar	B22753-14
Bioanalyzer	Agilent		Agilent 2100 Bioanalyzer
Embedding mold	Leica Biosystems	14702218311	6x8mm
Hydrophobic barrier pen	Vector Laboratories	H-4000
Frozen tissue embedding media	Tissue-Tek	4583
Bioanalyzer chip	Aligent Technologies	5067-1513	RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer
Hot start reaction mix for quantitative PCR	Roche	6402712001	Fast Start Essential DNA Green Master
Reverse transcriptase	Life technologies	11752-050	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR