RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung
Summary
Genexpressionsanalyse einer Untergruppe von Zellen in einem spezifischen Gewebe stellt eine große Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt, wie man qualitativ hochwertige Gesamt-RNA aus einer bestimmten Zellpopulation durch die Kombination einer schnellen Immunomarkierung Verfahren mit Laser Mikrodissektion zu isolieren.
Abstract
Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ermöglicht die Isolierung von spezifischen Zellen von Gewebedünnschnitten mit hoher räumlicher Auflösung. Effektive LCM erfordert eine genaue Identifizierung von Zellen-Subpopulationen aus einer heterogenen Gewebe. Identifizierung von Zellen von Interesse hinsichtlich LCM wird normalerweise auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierendes Protein Reporter basiert. Die Kombination von LCM und schnelle Immunomarkierung bietet eine Alternative und effizientes Mittel, um spezifische Zelltypen zu visualisieren und um sie vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Hochwertige RNA kann dann von einer reinen Zellpopulation extrahiert werden und für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR weiterverarbeitet werden. Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Veröffentlichungen beschrieben. Das Ziel dieses Artikels ist es zu zeigen, wie eine schnelle Immunmarkierung einer Zellpopulation durchzuführen und dabei RNA Integrität, und wie man diese spezifischen Zellen mit LCM isolieren. Hierin zeigen wird dieses mehrstufigen Verfahrens durch Immunmarkierung und die Erfassung dopaminergen Zellen im Hirngewebe von einem Tage alten Mäusen. Wir heben Taste kritischen Schritte, die besondere Beachtung verdienen. Dieses Protokoll kann auf eine Vielzahl von Geweben und Zellen von Interesse angepasst werden. Forscher aus verschiedenen Bereichen wird wahrscheinlich von der Demonstration dieses Ansatzes profitieren.
Introduction
Das Gehirn ist von einer großen Vielfalt von verschiedenen Neuronentypen Bilden komplexer Netzwerke zusammen. Diese Neuronen sind in verschiedene Gruppen und Untergruppen nach ihrer Morphologie, Konnektivität und Genexpressionsmuster 1 organisiert. Die Entwicklung von Mikroarrays, der nächsten Generation Sequenzierung und qRT-PCR bot die Möglichkeit, Genexpressionsprofile von neuronaler Populationen in verschiedenen biologischen Kontexten 1,2 zu vergleichen. Diese empfindlichen Analysen erfordern die präzise Identifizierung und Isolierung von Zelltypen von Interesse während RNA Integrität 2-4. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Technik wurde allgemein verwendet, um spezifische Zelltypen, basierend auf Zelloberflächen-Marker und / oder Morphologie zu isolieren. FACS benötigt eine Zellabtrennungsschritt vor der Sortierung, die in einem vollständigen Verlust der räumlichen Auflösung 5 führt. Viele neuronalen Subpopulationen voneinander unterschieden entsprechend ihrer anatomischen Verteilung in the Gehirn. Laser Mikrodissektion auf dünnen Gehirnschnitte angewendet bietet eine geeignete Option für spezifische Isolierung von Zellen mit hoher räumlicher Auflösung 6-8. Eine Hauptbeschränkung von LCM wurde die Notwendigkeit, Zellen von Interesse, basierend auf morphologischen Kriterien oder fluoreszierenden Reporterproteine genetisch in Tiermodellen entwickelt identifizieren. Die Entwicklung neuer Techniken, um schnell Immunomarkierung Methoden, die RNA-Integrität bewahrt, in Kombination mit LCM durchzuführen, erlaubt nun die Isolierung von Zellpopulationen mit Gen-Profiling-Experimente fort.
Dieser Ansatz wurde bereits durchgeführt wurden und kurz in einigen Publikationen 1,9-13 beschrieben. Hier zeigen wir ein detailliertes Verfahren zu hochwertigen RNA von einer bestimmten Untergruppe von Zellen in einer komplexen Gewebestruktur durch Kombinieren schnellen Immunmarkierung mit LCM erhalten. Wir zeigen, wie die wichtigsten kritischen Schritte durchführen, um eine maximale RNA-Gewinnung zu erhalten und zu vermeiden RNA-Abbau wie es siglich Auswirkungen Genexpressionsanalysen.
Zur Demonstration dieses Protokoll wurden dopaminergen Neuronen von einem Tag alten Maushirn abgezielt. Dopaminergen Neuronen kann mit Hilfe eines gegen Tyrosinhydroxylase (TH) gerichteten Antikörpers, des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms für Dopaminsynthese immunolabeled werden. Nach TH Immunfärbung können einzelne oder Gruppen von dopaminergen Neuronen dann mit LCM isoliert werden. Mikrodissezierten Zellen werden in Lysepuffer gesammelt und RNA wird mit Hilfe eines RNA-Extraktions-Kit extrahiert. Qualität und Quantität der RNA extrahiert werden mit einem Bioanalyzer 5 gemessen. Die weitere Analyse der Genexpression mit: RNA-Sequenzierung, Microarray oder qRT-PCR kann anschließend durchgeführt 2,4,6 werden. Als ein Beispiel wird ein zweistufiger qRT-PCR von den Laser erfassten isolierten dopaminergen Domänen gezeigt. Die relative Quantifizierung der Expressionsniveaus von zwei dopaminergen Neurons Markergene zeigt die Selektivität dieses Protokolls.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der kritischste Punkt dieses Verfahrens besteht darin, die Markierung von Zellen von Interesse, während verhindert RNA-Abbau. Wie RNAsen in wässrigen Lösungen aktiv sind, abnehm Inkubationszeiten verbessert RNA Erhaltung 11,15. Alle verwendeten Lösungen müssen mit DEPC, um RNasen zu inaktivieren behandelt werden. Alle Materialien und Oberflächen benötigen, um mit einer Oberfläche RNAse Dekontaminationslösung zu RNAsen Kontamination zu verhindern behandelt werden. Schließlich wird in diesen Bedingung…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
Referências
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain : a journal of neurology. 133 (Pt 7), 2022-2031 (2010).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 21 (1), 31-47 (2013).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Mahalingam, M. Laser capture microdissection: methods and applications. Methods in molecular biology. 755, 1-15 (2011).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert review of molecular diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
- Fend, F., Raffeld, M. Laser capture microdissection in pathology. Journal of clinical pathology. 53 (9), 666-672 (2000).
- Chadi, G., Maximino, J. R., de Oliveira, G. P. The importance of molecular histology to study glial influence on neurodegenerative disorders. Focus on recent developed single cell laser microdissection. Journal of molecular histology. 40 (4), 241-250 (2009).
- Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of biomolecular techniques : JBT. 21 (3), 120-125 (2010).
- Baskin, D. G., Bastian, L. S. Immuno-laser capture microdissection of rat brain neurons for real time quantitative PCR. Methods in molecular biology. 588, 219-230 (2010).
- Brown, A. L., Smith, D. W. Improved RNA preservation for immunolabeling and laser microdissection. RNA. 15 (12), 2364-2374 (2009).
- Brown, A. L., Brown, A. L., Day, T. A., Dayas, C. V., Smith, D. W. Purity and enrichment of laser-microdissected midbrain dopamine neurons. BioMed research international. 2013, 747938 (2013).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney international. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Greene, J. G., Dingledine, R., Greenamyre, J. T. Gene expression profiling of rat midbrain dopamine neurons: implications for selective vulnerability in parkinsonism. Neurobiology of disease. 18 (1), 19-31 (2005).
- Chung, C. Y., Koprich, J. B., Endo, S., Isacson, O. An Endogenous Serine/Threonine Protein Phosphatase Inhibitor, G-Substrate, Reduces Vulnerability in Models of Parkinson’s Disease. Journal of Neuroscience. 27 (31), 8314-8323 (2007).
- Pfaffl, M. Chapter 3, Quantification strategies in real-time. AZ of quantitative PCR. , (2004).
- Smolinski, D., Blessenohl, M., Neubauer, C., Kalies, K., Gebert, A. Validation of a novel ultra-short immunolabeling method for high-quality mRNA preservation in laser microdissection and real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction). The Journal of MolecularDiagnostics. 8 (2), 246-253 (2006).
- Podgornyĭ, O. V., Lazarev, V. N., Govorun, V. M. Laser microdissection for biology and medicine. Tsitologiia. 54 (5), 381-389 (2012).
- Vandewoestyne, M., ewoestyne & Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. International journal of legal medicine. 124 (6), 513-521 (2010).
- Shapiro, J. P., et al. A quantitative proteomic workflow for characterization of frozen clinical biopsies: laser capture microdissection coupled with label-free mass spectrometry. Journal of. 77, 433-4340 (2012).
- Domazet, B., Maclennan, G. T., Lopez-Beltran, A., Montironi, R., Cheng, L. Laser capture microdissection in the genomic and proteomic era: targeting the genetic basis of cancer. International journal of clinical and experimental pathology. 1 (6), 475-488 (2008).
