Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling
Summary
Gene análise de um subconjunto de células num tecido específico de expressão representa um grande desafio. Este artigo descreve como isolar RNA total de alta qualidade a partir de uma população de células específicas, combinando um método rápido imunomarcação com captura a laser microdissection.
Abstract
Captura laser microdissecação (LCM) permite o isolamento de células específicas a partir de secções de tecido fino com uma elevada resolução espacial. LCM eficaz requer a identificação precisa das células as subpopulações de um tecido heterogêneo. Identificação de células de interesse para LCM é geralmente baseada em critérios morfológicos ou em repórteres proteína fluorescente. A combinação de LCM e imunomarcação rápida oferece um meio alternativo e eficientes para visualizar tipos específicos de células e para isolá-los do tecido circundante. ARN de elevada qualidade pode então ser extraído a partir de uma população de células pura e adicionalmente processados para aplicações a jusante, incluindo a sequenciação de ARN, ou de microarray de qRT-PCR. Esta abordagem foi realizada previamente e brevemente descrito em poucas publicações. O objetivo deste artigo é ilustrar como realizar imunomarcação rápida de uma população de células, mantendo a integridade do RNA, e como isolar essas células específicas usando LCM. Nisto, nós ilustrard este processo multi-passo por imunomarcação e captura das células dopaminérgicas em tecido cerebral de ratos de um dia de idade. Destacamos etapas críticas fundamentais que merecem uma atenção especial. Este protocolo pode ser adaptado a uma variedade de tecidos e células de interesse. Pesquisadores de diferentes áreas provavelmente serão beneficiados com a demonstração desta abordagem.
Introduction
O cérebro é composto de uma grande variedade de diferentes tipos de neurónios, formando redes complexas. Esses neurônios são organizados em grupos e subgrupos distintos de acordo com a sua morfologia, conectividade e expressão gênica padrão 1. O desenvolvimento de microarrays, sequenciamento de próxima geração, e qRT-PCR oferecida a possibilidade de comparar os perfis de populações neuronais de expressão gênica em diferentes contextos biológicos 1,2. Estas análises sensíveis exigem a identificação precisa e isolamento de tipos de células de interesse, mantendo a integridade do RNA 2-4. De células (FACS) activada fluorescente técnica tem sido amplamente utilizada para isolar tipos específicos de células com base em marcadores da superfície celular e / ou morfologia. FACS requer um passo de dissociação de células antes da separação, o que resulta numa perda total de resolução espacial 5. Muitos subpopulações neuronais são distinguidas uma da outra de acordo com sua distribuição anatômica em the cérebro. Microdissection captura Laser aplicado em seções cerebrais finas oferece uma opção adequada para o isolamento específico de células com alta resolução espacial 6-8. Uma das principais limitações da LCM tem sido a necessidade de identificar as células de interesse com base em critérios morfológicos ou repórteres fluorescentes em proteína geneticamente em modelos animais. O desenvolvimento de novas técnicas para realizar métodos de imunomarcação rápidas que preservaram a integridade de ARN, em combinação com LCM, agora permite o isolamento de subpopulações de células para continuar com as experiências de perfilação de genes.
Esta abordagem foi realizada previamente e brevemente descrito em poucas publicações 1,9-13. Aqui, demonstramos um procedimento detalhado para a obtenção de RNA de alta qualidade a partir de um subconjunto específico de células de uma estrutura de tecido complexo pela combinação rápida de imunomarcação com GCV. Mostramos como executar passos fundamentais essenciais para obter a recuperação RNA máxima e evitar a degradação do RNA, pois pode sigcativamente gene impacto perfil de expressão.
Para a demonstração deste protocolo, os neurônios dopaminérgicos de um dia de idade, mesencéfalo rato foram alvejados. Neurónios dopaminérgicos pode ser immunolabeled utilizando um anticorpo dirigido contra a tirosina hidroxilase (TH), a enzima limitante da velocidade para a síntese de dopamina. Após imunocoloração TH, individuais ou grupos de neurónios dopaminérgicos pode, então, ser isolado usando LCM. Microdissecadas células são recolhidos no tampão de lise, e o ARN é extraído usando um kit de isolamento de ARN. Qualidade e quantidade do RNA extraído são medidos usando um Bioanalyzer 5. Uma análise mais aprofundada da expressão gênica usando: RNA seqüenciamento, microarray, ou qRT-PCR pode, posteriormente, ser realizada 2,4,6. Como um exemplo, um de dois passos de qRT-PCR é demonstrado nos domínios de laser capturado isolado dopaminérgicos. A quantificação relativa dos níveis de genes marcadores neurônio dois dopaminérgicos expressão ilustra a seletividade deste protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ponto mais crítico deste método consiste na marcação das células de interesse, evitando a degradação do RNA. Como RNAses estão ativos em soluções aquosas, diminuindo os tempos de incubação melhora a conservação RNA 11,15. Todas as soluções utilizadas devem ser tratada com DEPC para inactivar ARNases. Todos os materiais e as superfícies devem ser tratados com uma solução de ARNase a descontaminação de superfície para evitar a contaminação ARNases. Finalmente, em estas condições, a a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
Referências
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