成像本地CA<sup> 2+</sup>在培养的哺乳动物细胞信号
Summary
Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.
Abstract
胞质的Ca 2+离子的调节在几乎所有类型的细胞的细胞活性的许多方面，控制流程作为广泛作为基因转录，电兴奋性和细胞增殖。 钙离子信号的多样性和特异性的发生在几分钟到局部瞬时钙微区的时间用来生成钙信号采取行动在不同的时间和空间尺度的机制，从细胞级振荡和电磁波派生（ 钙离子喷）持久毫秒。在电子的最新进展乘以CCD（EMCCD）相机，现在允许本地钙信号与128×128像素的空间分辨率成像为> 500帧秒-1（fps）的速率。这种方法是高度并行的，并能够在一个单一实验中同时监测数百个频道或粉扑站点的。然而，所产生的大量数据（ 约 1千兆PER最小值）渲染视觉识别本地钙和分析2+事件不可行。在这里，我们将介绍和演示程序的采集，检测，以及本地IP 3介导的钙信号加载同时使用宽视场落射荧光（WF）和全内反射钙指标完整的哺乳动物细胞分析荧光（TIRF）显微镜。此外，我们描述了开放源码的软件环境的Python，自动化这些地方的钙离子信号的识别和分析中开发了一种算法。该算法本地化的钙释放与子像素分辨率的场所;允许数据的用户查看;输出的荧光信号比时间序列与幅度和动力学数据在Excel兼容的表格。
Introduction
钙离子（ 钙 ）遍在调节生物学过程，包括基因表达，分泌和在突触可塑性1持久的变化的一个不同的范围。通过这些钙离子可以在这样一个多元化的方式行事的一种方法是通过钙离子的不同的时空格局预示着细胞可以生成。对于胞浆例如全球海拔在平滑肌组织2而较小的[Ca 2+]触发收缩，局部的暂时升高（局部钙微区）刺激基因表达的学习和记忆至关重要的3。
游离胞质内[Ca 2+]被维持在约100纳米处，休息，但能迅速通过钙上升到几个微摩尔以下的Ca 2+的流入到胞质溶胶定位于质膜和由2+ -permeable离子通道钙离子从细胞内的S中解放tores。我们实验室的重点是肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP 3 R），其形成位于内质网（ER）膜中的钙释放通道。一旦这两个IP 3和Ca 2+胞浆激活受体位点结合，将IP 3 R通道打开，释放钙离子的ER管腔内隔离。的Ca 2+的释放可保持空间限制到一小簇的IP 3卢比生成的Ca的本地胞质微区2+（钙离子粉扑4），或者，依赖于邻近簇的IP 3 Rs的接近度，可通过钙离子诱导的Ca 2+ -释放（CICR）5,6的过程中多个招聘网站噗传播在整个细胞。
荧光小分子的Ca 2+指示剂染料引入由Roger开发钱学森7，再加上先进的显微镜意马纳克技术，极大地方便了我们的Ca 2+信号的认识。在用于显微镜相机最近的进展，现在允许成像瞬态本地的Ca 2+的事件，如喷以前所未有的空间和时间分辨率。目前可用的EMCCD相机使成像128×128象素，在> 500帧秒-1（fps）的和新一代互补金属氧化物半导体的（CMOS）摄像机提供更高的像素分辨率，并且在稍高的费用，甚至更快的速度噪音水平。在与全内反射（TIRF）显微镜结合使用，现在可以像单钙通道事件8,9。这种方法允许数百同时频道/事件的成像，同时产生大的数据集（每分钟大约 1Gb的），该渲染人工处理，视觉识别和分析不可行和放置一个责任上的自动算法的发展。
<p class ="“jove_content”">在这里，我们目前使用的荧光钙指标成像在完整的哺乳动物细胞局部钙信号的程序和协议。我们进一步证明了开源环境的Python可以自动识别本地钙事件双方TIRF和传统的宽视场落射荧光（WF）显微成像和分析开发了一种算法。尽管我们描述了这些方法中的IP 3 -生成的Ca 2+信号的情况下，它们是很容易适合于研究在胞浆内[Ca 2+]从各种钙发出位于任一表面2+ -permeable离子通道的局部变化细胞膜或细胞内的细胞器8-10。Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了协议成像培养的哺乳动物细胞局部钙事件使用荧光钙指标。此外，我们描述了一种算法可以自动识别和获取的数据进行分析的直观的用户界面。这里所描述的方法利用荧光钙指标加州-520，但其他许多钙敏感染料如荧光- 3，荧光4，荧光- 8和俄勒冈州绿BAPTA-1进行足够好图像的Ca 2+微区。护理确实需要采取以确保这些指标的高亲和性的版本?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.
Materials
| Name | Company | Catalogue No. |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) | SiChem | cag-iso-2-145-10 |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35-1.5-14-C |
Referências
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