इमेजिंग स्थानीय सीए<sup> 2 +</sup> संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में सिग्नल
Summary
Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.
Abstract
साइटोसोलिक सीए 2 + आयनों के रूप में जीन प्रतिलेखन, बिजली excitability और सेल प्रसार के रूप में व्यापक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने, लगभग सभी प्रकार की कोशिकाओं में सेलुलर गतिविधि के कई पहलुओं को विनियमित। सीए 2 + संकेतन की विविधता और विशिष्टता स्थानीय क्षणिक सीए 2 + microdomains मिनट की अवधि में होने वाली सेल चौड़ा दोलनों और लहरों से लेकर सीए 2 + संकेतों अलग समय और स्थानिक तराजू से अधिक कार्य करने के लिए उत्पन्न कर रहे हैं जिसके द्वारा तंत्र से निकला (सीए 2 + कश) तक चलने मिसे। इलेक्ट्रॉन में हाल के अग्रिमों सीसीडी (EMCCD) कैमरों अब> 500 फ्रेम सेकंड -1 (एफपीएस) की दर पर एक 128 x 128 पिक्सेल स्थानिक संकल्प के साथ स्थानीय सीए 2 + संकेतों के इमेजिंग के लिए अनुमति गुणा। यह दृष्टिकोण अत्यधिक समानांतर है और एक ही प्रयोग में चैनल या कश साइटों के सैकड़ों के एक साथ निगरानी में सक्षम बनाता है। हालांकि, डेटा की विशाल मात्रा में उत्पन्न (सीए 1 जीबी पीईआर मिनट) 2 + घटनाओं अव्यवहारिक स्थानीय सीए के दृश्य पहचान और विश्लेषण प्रस्तुत करना। यहाँ हम का वर्णन है और अधिग्रहण, का पता लगाने के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन, और व्यापक क्षेत्र महामारी प्रतिदीप्ति (WF) और कुल आंतरिक प्रतिबिंब दोनों का उपयोग कर सीए 2 + संकेतक के साथ भरी हुई बरकरार स्तनधारी कोशिकाओं में सीए 2 + संकेतों मध्यस्थता तीन स्थानीय आईपी के विश्लेषण प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी। इसके अलावा, हम इन स्थानीय सीए 2 + संकेतों की पहचान और विश्लेषण automates कि खुले स्रोत सॉफ्टवेयर वातावरण अजगर के भीतर विकसित एक एल्गोरिथ्म का वर्णन है। एल्गोरिथ्म उप पिक्सेल संकल्प के साथ सीए 2 + रिहाई की साइटों localizes; डेटा के उपयोगकर्ता समीक्षा अनुमति देता है; और एक एक्सेल-संगत तालिका में आयाम और गतिज डेटा के साथ एक साथ प्रतिदीप्ति अनुपात संकेतों के समय दृश्यों outputs।
Introduction
कैल्शियम आयन (सीए 2 +) सर्वत्र जीन अभिव्यक्ति, स्राव और synaptic plasticity के एक में लंबे समय से स्थायी परिवर्तन सहित जैविक प्रक्रियाओं, की एक विविध रेंज को विनियमित। सीए 2 + इस तरह के एक विविध तरीके से कार्य कर सकते हैं, जिसके माध्यम से एक तरह से सीए 2 + के विभिन्न स्थानिक और लौकिक पैटर्न के माध्यम से एक सेल उत्पन्न कर सकते हैं का संकेत है। साइटोसोलिक में उदाहरण के वैश्विक उन्नयन चिकनी मांसपेशियों के ऊतकों को दो जबकि छोटे में [सीए 2 +] ट्रिगर संकुचन, स्थानीय क्षणिक उन्नयन (स्थानीय सीए 2 + microdomains) के लिए सीखने और स्मृति 3 के लिए आवश्यक जीन की अभिव्यक्ति को प्रोत्साहित।
नि: शुल्क साइटोसोलिक [सीए 2 +] ~ 100 एनएम पर बाकी पर बनाए रखा है, लेकिन तेजी से सीए के माध्यम से cytosol में सीए 2 + की आमद के बाद कई सूक्ष्म दाढ़ के लिए प्लाज्मा झिल्ली में और से स्थित 2 + -permeable आयन चैनल वृद्धि कर सकते हैं इंट्रासेल्युलर s से सीए 2 + की मुक्तिTores। हमारी प्रयोगशाला endoplasmic जालिका (ईआर) झिल्ली में स्थित एक सीए 2 + रिलीज़ चैनल जो रूपों inositol 1,4,5-trisphosphate रिसेप्टर (आईपी 3 आर), पर केंद्रित है। रिसेप्टर की साइटों को सक्रिय साइटोसोलिक करने के लिए दोनों आईपी 3 और सीए 2 + के बंधन पर, आईपी 3 आर चैनल सीए 2 + ईआर लुमेन भीतर तनहा आजाद कराने के लिए खुलता है। सीए 2 + की रिहाई के स्थानिक (सीए 2 + कश 4) 2 + सीए की एक स्थानीय साइटोसोलिक microdomain उत्पन्न करने के लिए आईपी तीन रुपये के एक छोटे समूह तक ही सीमित रह सकता है या, आईपी 3 रुपये का पड़ोसी समूहों की निकटता के आधार पर, हो सकता है सीए 2 + -induced सीए 2 + -release (CICR) 5,6 की एक प्रक्रिया के माध्यम से कई कश साइटों की भर्ती द्वारा एक सेल भर में प्रचार।
उन्नत माइक्रोस्कोपी imagi के साथ युग्मित Tsien 7 रोजर द्वारा विकसित फ्लोरोसेंट छोटे अणु सीए 2 + सूचक रंगों की शुरूआततकनीक एनजी, सीए 2 + संकेतन के बारे में हमारी समझ में मदद की बहुत गया है। माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया कैमरे में हाल के अग्रिमों अब ऐसी अभूतपूर्व स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ कश के रूप में क्षणिक स्थानीय सीए 2 + घटनाओं इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं। वर्तमान में उपलब्ध EMCCD कैमरों> 500 फ्रेम सेकंड -1 (एफपीएस) और पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक की नई पीढ़ी में 128 x 128 पिक्सल के साथ इमेजिंग सक्षम) (CMOS कैमरों से थोड़ा अधिक की कीमत पर उच्च पिक्सेल संकल्प, और भी तेजी से गति प्रदान शोर का स्तर। कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIRF) माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन के रूप में छवि के लिए अब एक सीए 2 + चैनल घटनाओं 8,9 संभव है। अव्यवहारिक पुस्तिका प्रोसेसिंग, दृश्य पहचान और विश्लेषण प्रस्तुत करना और स्वचालित एल्गोरिदम के विकास पर एक जिम्मेदारी उस जगह बड़े डेटा सेट (न्यूनतम प्रति सीए 1GB) पैदा करने हैं, जबकि यह दृष्टिकोण, एक साथ चैनल / घटनाओं के सैकड़ों की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है।
<p clasएस = "jove_content"> यहाँ, हम फ्लोरोसेंट सीए 2 + संकेतकों का उपयोग बरकरार स्तनधारी कोशिकाओं में स्थानीय सीए 2 + संकेतों इमेजिंग के लिए प्रक्रियाओं और प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम आगे TIRF और पारंपरिक विस्तृत क्षेत्र महामारी प्रतिदीप्ति (WF) माइक्रोस्कोपी दोनों ने उतारी स्थानीय सीए 2 + घटनाओं की पहचान और विश्लेषण automates कि खुले स्रोत वातावरण अजगर में विकसित एक एल्गोरिथ्म प्रदर्शित करता है। हम आईपी सीए 2 + संकेतों -generated 3 के संदर्भ में इन तरीकों का वर्णन है, वे [सीए 2 +] सीए की एक किस्म से या तो सतह में स्थित 2 + -permeable आयन चैनल निकलती साइटोसोलिक में स्थानीय परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए आसानी से उत्तरदायी हैं झिल्ली या intracellular organelles के 8-10।Protocol
Representative Results
Discussion
हम यहाँ वर्णन फ्लोरोसेंट सीए 2 + संकेतकों का उपयोग सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं में स्थानीय सीए 2 + घटनाओं इमेजिंग के लिए प्रोटोकॉल। इसके अलावा, हम पहचान और प्राप्त डेटा के विश्लेषण automates कि एक सहज …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.
Materials
| Name | Company | Catalogue No. |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) | SiChem | cag-iso-2-145-10 |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35-1.5-14-C |
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