Imagem local Ca²⁺ Sinais em células de mamíferos em cultura

Summary

Here we present techniques for imaging local IP₃-mediated Ca²⁺ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca²⁺ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Abstract

Citossólica Ca ²⁺ regular vários aspectos da atividade celular em quase todos os tipos de células, processos tão diversos como a transcrição de genes, excitabilidade elétrica e proliferação celular controle. A diversidade e especificidade de Ca ²⁺ sinalização deriva de mecanismos pelos quais Ca ²⁺ sinais são gerados para atuar em diferentes escalas de tempo e espaciais, que vão desde oscilações e ondas em toda a célula que ocorrem durante os períodos de minutos locais transitórias Ca ²⁺ microdomínios (Ca ²⁺ puffs) milésimos duradoura. Os recentes avanços na eletrônica multiplicado CCD (EMCCD) câmeras permitem agora para a imagem latente de ²⁺ sinais locais de Ca com uma resolução espacial de 128 x 128 pixels em taxas de quadros> 500 ^s-1 (FPS). Esta abordagem é altamente paralelo e permite a monitorização simultânea das centenas de canais ou sítios sopro numa única experiência. No entanto, a grande quantidade de dados gerados (cerca de 1 Gb per min) tornar a identificação visual e análise de Ca ²⁺ eventos locais impraticável. Aqui nós descrevemos e demonstrar os procedimentos para a aquisição, detecção e análise de IP local ₃ mediada por Ca ²⁺ sinais em células de mamíferos intactos carregados com ^{Ca2 +} indicadores que utilizam tanto de campo amplo epi-fluorescência (WF) e de reflexão interna total fluorescência (TIRF) microscopia. Além disso, descrevemos um algoritmo desenvolvido dentro do open-source software ambiente Python que automatiza a identificação e análise desses Ca ²⁺ sinais locais. O algoritmo localiza locais de Ca ²⁺ liberação com resolução sub-pixel; permite a revisão dos dados do usuário; e produz sequências de tempo de sinais de relação de fluorescência em conjunto com amplitude e dados cinéticos em uma tabela do Excel-compatível.

Introduction

Os íons de cálcio (Ca ²⁺⁾ ubíqua regular uma gama diversificada de processos biológicos, incluindo a expressão do gene, secreção e mudanças de longa duração em plasticidade sináptica ^1. Uma maneira através da qual Ca ²⁺ pode agir de maneira tão diversa é através dos diferentes padrões espaciais e temporais de Ca ²⁺ sinaliza uma célula pode gerar. Por exemplo, as elevações globais em cytosolic [Ca ^2+] contração gatilho no tecido muscular liso ² Considerando menor, elevações transitórias localizadas (locais Ca ²⁺ Microdomínios) estimular a expressão essencial para a aprendizagem e memória ³ gene.

Citosólico livre [Ca ^2+] é mantida a ~ 100 nM em repouso, mas pode levantar-se rapidamente de várias micro-molar seguindo o influxo de Ca2 ⁺ no citosol através de canais de Ca2 ⁺ de iões -permeable localizados na membrana do plasma e pela a libertação de Ca2 ⁺ a partir de s intracelularestores. O nosso laboratório concentra-se o receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP ₃ R), que forma um canal de Ca2 ⁺ de libertação localizado na membrana do retículo endoplasmático (ER). Após a ligação de ambos _IP3 e Ca ²⁺ para a activação citosólica sítios do receptor, o canal IP R ₃ se abre para libertar o Ca2 ⁺ sequestrado dentro do lúmen do ER. A libertação de Ca2 ⁺ pode permanecer limitada espacialmente, para um pequeno grupo de IP ₃ Rs para gerar um microdomínio citosólica locais de Ca2 ⁺ (Ca2 ⁺ sopro ^4), ou, dependendo da proximidade de aglomerados vizinhos de IP ₃ Rs, pode propagar ao longo de uma célula através do recrutamento de vários sites de sopro através de um processo de Ca2 ⁺ induzida por Ca2 ⁺ -release (CICR) ^5,6.

A introdução de pequenas molécula fluorescente de Ca ²⁺ corantes indicadores desenvolvido por Roger Tsien ^7, juntamente com o avançado imagi microscopiatécnicas Ng, facilitou muito a nossa compreensão do Ca ²⁺ sinalização. Recentes avanços em câmeras usadas para microscopia agora permitir transitórias de imagem locais Ca ²⁺ eventos como puffs com inédita resolução espacial e temporal. Atualmente câmeras EMCCD disponíveis permitem imagem com 128 x 128 pixels em> 500 quadros seg ^-1 (fps) e da nova geração de complementar semicondutor de óxido metálico (CMOS) câmeras proporcionar maior pixels de resolução e velocidade ainda mais rápido à custa de um pouco maior níveis de ruído. Em conjunto com a microscopia de reflexão interna total (TIRF) agora é possível imagem única Ca ²⁺ eventos canal ^8,9. Esta abordagem permite que a imagem de centenas de canais / eventos simultaneamente, ao gerar grandes conjuntos de dados (cerca de 1 GB por min) que tornam o processamento manual, identificação visual e análise impraticável e colocar um ônus sobre o desenvolvimento de algoritmos automáticos.

<p class = "jove_content"> Aqui, apresentamos os procedimentos e protocolos de imagem Ca ²⁺ sinais locais em células de mamíferos intactos usando fluorescentes Ca ²⁺ indicadores. Demonstramos ainda um algoritmo desenvolvido no ambiente Python open-source que automatiza a identificação e análise de ^{Ca2 +} eventos locais fotografados por ambos TIRF e microscopia de campo largo epi-fluorescência convencional (WF). Embora estas abordagens descrevemos no contexto da PI ₃ -generated Ca ²⁺ sinais, eles são facilmente recuperáveis ​​para estudar alterações locais na citosólica [Ca ^2+] emanados a partir de uma variedade de canais de Ca2 ⁺ de iões -permeable localizados quer na superfície membrana ou organelas intracelulares ^8-10.

Protocol

Nós apresentamos os procedimentos detalhados de imagem Ca 2+ eventos locais em neuroblastoma humano células SH-SY5Y. Estes procedimentos podem ser adaptados para a imagem de Ca 2+ intracelular sinais em muitos tipos de células 8-10. 1. Preparação de células Cultura as células a ser trabalhada de acordo com as instruções constantes no site do seu fornecedor. Alguns dias antes da imagiologia, colheita células cultivadas num frasco…

Representative Results

Figura 1A mostra uma imagem WF de descansar Cal-520 fluorescência em células neuroblastoma SH-SY5Y humanos também carregados com ci-IP 3. A exposição destas células para um flash de 100 ms para UV foto-release i-IP 3 suscitou transientes de Ca2 + puffs em locais discretos (apontadas pelos círculos brancos na Figura 1A). Vestígios de fluorescência medidos nesses locais mostraram uma fase crescente, devido à rápida aberturas transientes de IP <s…

Discussion

Descrevemos aqui protocolos de imagem Ca ²⁺ eventos locais em células de mamíferos em cultura usando fluorescentes Ca ²⁺ indicadores. Além disso, descrevemos um algoritmo com uma interface de usuário intuitiva que automatiza a identificação e análise dos dados adquiridos. O procedimento aqui descrito utilizar o Ca ²⁺ indicador fluorescente Cal-520, mas muitos outros corantes de Ca2 ⁺ sensíveis, tais como Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Verde Oregon BAPTA-1 desempenho suficien…

Materials

Name	Company	Catalogue No.
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35-1.5-14-C