Görüntüleme Yerel Ca<sup> 2+</sup> Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller
Summary
Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.
Abstract
Sitosolik Ca + 2 iyonları, gen transkripsiyonu, elektriksel uyanlabilirliği ve hücre çoğalması gibi çok kapsamlı işlemlerin kontrol, hemen hemen tüm hücre tiplerinde hücresel aktivitesi sayısız yönlerini düzenleyen. Ca 2 + sinyalizasyon çeşitliliği ve özgünlüğü yerel geçici Ca 2 + microdomains dakika süre boyunca meydana gelen hücre çapında titreşimler ve dalgalar arasında değişen Ca 2 + sinyalleri farklı zaman ve mekansal ölçekler üzerinde hareket oluşturulur hangi mekanizmalar, türemiştir (Ca 2+ ponponları) kalıcı milisaniye. Elektron son gelişmeler CCD (EMCCD) kameralar artık> 500 kare saniye -1 (fps) oranlarında 128 x 128 piksel mekansal çözünürlüğe sahip yerel Ca 2 + sinyalleri görüntüleme için izin çarpılır. Bu yaklaşım son derece paralel ve tek bir deneyde kanallar veya puf sitelerin yüzlerce eşzamanlı izlenmesini sağlar. Ancak, verilerin büyük miktarlarda üretilen (yaklaşık 1 Gb per dk) 2+ olayları uygulanamaz yerel Ca görsel kimlik ve analiz kılıyor. Burada tarif ve satın alma, algılama için prosedürleri göstermek ve geniş alan epi-floresan (WF) ve toplam iç yansıma ikisini de kullanarak Ca 2 + göstergeleri ile yüklenen sağlam memeli hücrelerinde Ca 2+ sinyalleri aracılı 3 yerel IP analizi floresan (TIRF) mikroskopi. Ayrıca, bu yerel Ca 2 + sinyallerin belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak yazılım ortamı Python içinde geliştirilen bir algoritma tarif. algoritma alt piksel çözünürlüğe sahip Ca 2+ sürümü siteleri lokalize; veri kullanıcı gözden sağlar; ve bir Excel uyumlu tabloda genlik ve kinetik verileri ile birlikte floresan oranı sinyallerinin zaman dizilerini çıktılar.
Introduction
Kalsiyum iyonları (Ca 2+) yayg gen ifadesi, sekresyon ve sinaptik plastisite 1 uzun ömürlü değişiklikler dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin, çeşitli bir yelpazede düzenler. Ca 2 + Böyle farklı bir şekilde hareket hangi aracılığıyla bir yolu Ca 2+ farklı mekansal ve zamansal desenleri ile bir hücre oluşturabilir sinyalleri. Sitozolik örnek küresel yükselme düz kas dokusu 2 ise daha küçük [Ca 2+] tetik daralma, lokalize geçici yükselmeler (yerel Ca 2 + mikro bölgeler) için öğrenme ve bellek 3 için gerekli gen ifadesini teşvik.
Ücretsiz sitozolik [Ca 2 +] ~ 100 nM dinlenme tutulur, fakat hızla Ca ile sitozolüne Ca 2+ akını aşağıdaki birkaç mikro-molar plazma zarı ve yanında bulunan 2 + -geçirgen iyon kanallarını çıkabilir hücre içi s Ca 2+ kurtuluştores. Bizim laboratuvar endoplazmik retikulum (ER) zarında bulunan Ca 2 + bırakma kanalı oluşturan inositol 1,4,5-trifosfat alıcısı (IP 3 R), odaklanır. Reseptör siteleri aktive sitozolik hem IP 3 ve Ca 2+ bağlanması üzerine, IP 3 R kanalı Ca 2 + ER lümeninde tecrit kurtarmak açılır. Ca 2+ salınımı uzamsal (Ca 2 + puf 4) 2+ Ca yerel sitozolik mikro oluşturmak için IP 3 Rs küçük bir küme sınırlı kalabilir veya IP 3 Rs komşu kümelerinin yakınlığı bağlı olabilir Ca 2+ indüklediği Ca 2 + -salınımı (YÜÇAM) 5,6 süreciyle birden puf siteleri işe bir hücre boyunca yaymak.
Gelişmiş mikroskobu IMAGI ile birleştiğinde Tsien 7 Roger tarafından geliştirilen floresan küçük moleküllü Ca 2+ gösterge boyaların tanıtımı,teknikleri ng, Ca 2+ sinyalizasyon anlayışımızı büyük katkı sağlamaktadır. Mikroskopi için kullanılan kameralar son gelişmeler şimdi böyle görülmemiş mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip ponponları gibi geçici yerel Ca 2 + olayları görüntüleme için izin verir. Şu anda mevcut EMCCD kameralar> 500 kare saniye -1 (fps) ve tamamlayıcı metal oksit yarı iletken yeni nesil 128 x 128 piksel ile görüntüleme sağlayan (CMOS) kameralar biraz daha yüksek pahasına yüksek piksel çözünürlük, ve hatta daha hızlı sağlamak gürültü seviyeleri. Toplam iç yansıma (TIRF) mikroskopi ile birlikte bu görüntüye artık tek Ca 2 + kanal olayları 8,9 mümkündür. Impracticable manuel işleme, görsel kimlik ve analiz hale ve otomatik algoritmalarının geliştirilmesi yapma yükümlülüğü büyük veri setleri (min başına yaklaşık 1Gb) oluştururken Bu yaklaşım, aynı zamanda kanal / olayların yüzlerce görüntüleme için izin verir.
<p class = "jove_content"> Burada, biz floresan Ca 2 + göstergeleri kullanarak sağlam memeli hücrelerinde yerel Ca 2 + sinyalleri görüntüleme prosedürlerini ve protokolleri sunuyoruz. Biz daha TIRF ve geleneksel geniş alan epi-floresan (WF) mikroskopi hem görüntülü yerel Ca 2 + olayların belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak kodlu ortam Python geliştirilen bir algoritma göstermek. Biz IP Ca 2 + sinyalleri -generated 3 bağlamında bu yaklaşımları açıklamak rağmen, [Ca 2 +] Ca çeşitli ya yüzeye bulunan 2+ -geçirgen iyon kanallarını yayılan sitozolik yerel değişiklikleri incelemek için kolayca mükellef olan Membran ya da hücre içi organellerin 8-10.Protocol
Representative Results
Discussion
Biz burada açıklamak floresan Ca 2 + göstergeleri kullanarak kültürlü memeli hücrelerinde yerel Ca 2 + olayları görüntüleme için protokolleri. Ayrıca, kimlik ve elde edilen verilerin analizi otomatik bir sezgisel kullanıcı arayüzü ile bir algoritma tanımlamaktadır. Burada tarif edilen prosedür floresan Ca 2 + göstergesi Cal-520 kullanmak, ancak Flu-3, Flu-4, Flu-8 ve Oregon Yeşil BAPTA-1 gibi diğer birçok Ca 2 + duyarlı boyalar görüntü Ca yeterince …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.
Materials
| Name | Company | Catalogue No. |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) | SiChem | cag-iso-2-145-10 |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35-1.5-14-C |
Referências
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).
- Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).
- Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
- Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
- Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
- Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
- Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
- Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
- Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
- Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).
