Imaging Local Ca²⁺ Signaler i dyrkede pattedyrceller

Summary

Here we present techniques for imaging local IP₃-mediated Ca²⁺ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca²⁺ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Abstract

Cytosolisk Ca2 ⁺ ioner regulere mange aspekter af cellulær aktivitet i næsten alle celletyper, kontrollerende processer vidtrækkende som gentranskription, elektrisk ophidselse og celleproliferation. Mangfoldigheden og specificitet Ca2 ⁺ signalering stammer fra mekanismer, som Ca ^{2 +} signaler genereres til at handle over forskellige tidspunkter og rumlige skalaer, lige fra celle hele svingninger og bølger, der forekommer i løbet af de perioder minutter til lokale forbigående Ca ^{2 +} mikrodomæner (Ca ^{2 +} pust) varige millisekunder. Nylige fremskridt inden elektron multipliceret CCD (EMCCD) kameraer nu mulighed for billeddannelse af lokale Ca ^{2 +} signaler med en 128 x 128 pixel rumlig opløsning på hastigheder på> 500 frames sek ^-1 (fps). Denne fremgangsmåde er yderst parallel og muliggør samtidig overvågning af hundreder af kanaler eller puff sites i et enkelt eksperiment. Men de umådelige mængder af data, der genereres (ca. 1 GB per min) gør visuel identifikation og analyse af lokale Ca ^{2 +} begivenheder umuligt. Her beskriver vi, og demonstrere procedurerne for erhvervelse, afsløring og analyse af lokale IP ₃ medieret Ca ^{2 +} signaler i intakte pattedyrceller lastet med Ca ^{2 +} indikatorer ved hjælp af både bredt felt epi-fluorescens (WF) og total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi. Desuden beskriver vi en algoritme udviklet i open source software miljø Python, der automatiserer identifikation og analyse af disse lokale Ca ^{2 +} signaler. Algoritmen lokaliserer lokaliteter af Ca ²⁺ frigivelse med sub-pixel opløsning; giver brugeren mulighed for gennemgang af data; og udlæser tid sekvenser af fluorescensforhold signaler sammen med amplitude og kinetiske data i et Excel-kompatible tabel.

Introduction

Calcium ioner (Ca ²⁺⁾ allestedsnærværende regulere en bred vifte af biologiske processer, herunder genekspression, sekretion og langvarige ændringer i synaptisk plasticitet ^1. En måde, hvorigennem Ca2 ⁺ kan handle på en sådan forskelligartet måde er gennem de forskellige rumlige og tidslige mønstre af Ca ²⁺ signalerer en celle kan generere. For eksempel globale stigninger i cytosol [Ca2 ^+] trigger sammentrækning i glat muskelvæv ² mens mindre, lokaliserede forbigående stigninger (lokale Ca ^{2 +} mikrodomæner) stimulere genekspression af afgørende betydning for indlæring og hukommelse ^3.

Fri cytosol [Ca2 ^+] holdes på ~ 100 nM i hvile, men kan hurtigt stige til flere mikro-molær efter tilstrømningen af Ca ²⁺ i cytosolen via Ca2 ⁺ -permeable ionkanaler placeret i plasmamembranen og befrielsen af Ca ²⁺ fra intracellulære sTores. Vores laboratorium fokuserer på inositol 1,4,5-trisphosphat receptor _(IP3 R), som danner en Ca2 ⁺ release kanal beliggende i det endoplasmatiske reticulum (ER) membran. Ved binding af både _IP3 og Ca2 ⁺ til cytosoliske aktiverende steder i receptoren, _IP3 R kanal åbner at befri Ca ²⁺ afsondret inden ER lumen. Frigivelsen af Ca ²⁺ kan forblive rumligt begrænset til en lille klynge af IP ₃ R'er til at generere en lokal cytosolisk microdomain af Ca ²⁺ (Ca2 ⁺ puff ^4), eller, afhængigt af hvor tæt beslægtede klynger af IP ₃ R'er, kan udbrede gennem en celle ved at rekruttere flere puff sites gennem en Ca ^{2 +} -induceret Ca ²⁺ release (CICR) ^5,6.

Indførelsen af fluorescerende lille molekyle Ca ²⁺ indikatorfarvestoffer udviklet af Roger Tsien ^7, kombineret med avanceret mikroskopi fantasing teknikker, i høj grad har lettet vores forståelse af Ca2 ⁺ signalering. Nylige fremskridt i kameraer, der anvendes til mikroskopi nu mulighed for billeddannelse forbigående lokale Ca ^{2 +} begivenheder som pust med hidtil uset rumlig og tidsmæssig opløsning. Aktuelt tilgængelige EMCCD kameraer gør det muligt billeddannelse med 128 x 128 pixels ved> 500 frames sek ^-1 (fps), og den nye generation af komplementær metal-oxid halvleder (CMOS) kameraer giver højere pixel opløsning, og endnu hurtigere hastighed på bekostning af lidt højere støjniveauer. I forbindelse med total intern refleksion (TIRF) mikroskopi er det nu muligt at billedet enkelt Ca ²⁺ kanal events ^8,9. Denne fremgangsmåde giver mulighed for billeddannelse af hundredvis af kanaler / begivenheder samtidig, samtidig med at generere store datasæt (ca. 1 Gb per min), der gør manuel behandling, visuel identifikation og analyse praktisk muligt og placere en vægt på en udvikling af automatiserede algoritmer.

<p class = "jove_content"> Her præsenterer vi procedurer og protokoller for billeddannelse lokale Ca ^{2 +} signaler i intakte pattedyrceller under anvendelse af fluorescerende Ca ^{2 +} indikatorer. Vi viser yderligere en algoritme udviklet i open source miljø Python, der automatiserer identifikation og analyse af lokale Ca ^{2 +} arrangementer afbildet af både TIRF og konventionel bredt felt epi-fluorescens (WF) mikroskopi. Selvom vi beskrive disse metoder i forbindelse med IP ₃ -generated Ca2 ⁺ signaler, de er let medgørlige at studere lokale ændringer i cytosoliske [Ca2 ^+], der hidrører fra en række Ca2 ⁺ -permeable ionkanaler placeret i enten overfladen membran eller intracellulære organeller ^8-10.

Protocol

Vi præsenterer detaljerede procedurer for billeddannelse lokale Ca 2 + arrangementer i human neuroblastom SH-SY5Y celler. Disse procedurer kan tilpasses til billedet intracellulær Ca2 + signaler i mange celletyper 8-10. 1. Fremstilling af celler Kultur cellerne, der skal afbildes i henhold til vejledningen, der er opført på deres leverandørens hjemmeside. Et par dage før billeddannelse, høst celler dyrkes i en vævsdyrkningskolbe v…

Representative Results

Figur 1A viser en WF billede af hvilende Cal-520 fluorescens i humane neuroblastom SH-SY5Y celler også fyldt med CI-IP 3. Eksponering af disse celler til en 100 ms UV flash til foto-release I-IP 3 fremkaldte forbigående Ca 2+ pust ved diskrete steder (med de hvide cirkler konstateret i figur 1A). Fluorescens spor målt på disse steder viste en hurtig stigende fase grund forbigående åbninger af IP 3 R'er, efterfulgt af en meget langsom…

Discussion

Vi beskriver her protokoller til billeddannelse af lokale Ca2 ⁺ begivenheder i dyrkede pattedyrceller under anvendelse af fluorescerende ^{Ca2 +} indikatorer. Desuden beskriver vi en algoritme med en intuitiv brugergrænseflade, der automatiserer identifikation og analyse af indsamlede data. Den her beskrevne fremgangsmåde udnytter den fluorescerende Ca2 ⁺ indikator Cal-520, men mange andre Ca ²⁺ følsomme farvestoffer, såsom Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 og Oregon Green BAPTA-1 udfø…

Materials

Name	Company	Catalogue No.
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35-1.5-14-C