Doença de Dupuytren (DD) é uma doença fibroproliferativa da palma da mão. Aqui, apresentamos um protocolo para espécimes cultura de ressecção de DD em um (3D) sistema de cultura tridimensional. Tal sistema de cultura de curto prazo permite a preservação da estrutura 3D e propriedades moleculares do tecido fibrótico.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A fibrose de órgãos ou "cicatrizes" é conhecida por ser responsável por um alto número de mortes devido à extensa quantidade de distúrbios e órgãos afetados (de cirrose a doenças cardiovasculares). Não há tratamento eficaz e as ferramentas in vitro disponíveis não imitam a situação in vivo, tornando o progresso do processo de cicatrização de feridas fora de controle ainda enigmático.
Até o momento, culturas 2D e 3D de fibroblastos derivados de pacientes com DD são os principais modelos experimentais disponíveis. As culturas de células primárias têm muitas limitações; os fibroblastos derivados da DD são alterados pelas condições de cultura, carecem de contexto celular e interações, que são cruciais para o desenvolvimento da fibrose e representam fracamente o tecido derivado. A análise de PCR em tempo real de fibroblastos derivados de amostras de controle e DD mostra que pouca diferença é detectável. As culturas 3D de fibroblastos incluem a adição de matriz extracelular que altera as condições nativas dessas células.
Como forma de caracterizar as propriedades fibróticas e proliferativas desses espécimes de ressecção, desenvolvemos um sistema de cultura 3D, usando ressecções humanas intactas da parte do nódulo do cordão. O sistema é baseado em placas transwell com uma membrana de nitrocelulose acoplada que permite o contato do tecido com o meio, mas não com o plástico, evitando assim a alteração do tecido. Nenhum gel de colágeno ou outro substrato proteico da matriz extracelular é necessário. Os espécimes de ressecção tecidual mantêm sua viabilidade e propriedades proliferativas por 7 dias. Este é o primeiro sistema de cultura de "órgãos" que permite que amostras de ressecção humana de pacientes com DD sejam cultivadas ex vivo e testadas funcionalmente, recapitulando a situação in vivo.
Introdução
Doença de Dupuytren (DD), uma doença benigna fibroproliferativa provoca a flexão permanente dos dedos, devido à formação de nódulos e os cabos de na palma da mão. Embora a propagação da doença é particularmente elevado entre os caucasianos do norte da Europa, a etiologia genética subjacente da doença permanece desconhecida 1. A principal característica do DD o excesso de produção de proteínas da matriz extracelular (ECM) (por exemplo, colagénio), que formam um tecido fibroso resistente que ocupa o espaço entre os tendões e pele da palma da mão e dos dedos, interromper permanentemente os movimentos finos da mão 2, 3. A recorrência da doença sugere alterações genéticas subjacentes como causa da fibrose 1, 4. Um tratamento eficaz pode ser de alvejar diretamente os mecanismos fibróticas incontroláveis a nível celular e molecular.
Nosso trabalho recente sobre a fibrose nos levou ao desenvolvimento de umnovo sistema de cultura 3D que permite a cultura de curto prazo de tecido fibrótico humano com o potencial de teste de drogas. Este sistema tem ajudado a superar a abordagem limitante de culturas de fibroblastos em 2D e para definir um papel para a regulação para baixo parcial, conseguida por exon skipping, de TGF ativação da via na mediação fibrose 5.
Desenvolvemos um método para a cultura ex vivo a partir de amostras de ressecção humano doentes DD para estudar a interacção entre miofibroblastos e a ECM circundante 5, 6. O estudo de DD fibrose do tecido conjuntivo bem como outras doenças fibróticas baseia-se na análise histopatológica do cirúrgico excisado espécimes, o isolamento de fibroblastos a partir do tecido e estabelecimento de culturas primárias ou de procedimentos de separação de células. Estas abordagens são completamente estática, uma vez que não permitem a manipulação exógena das propriedades de doença ou intervenção terapêutica por parte do experimentador. Além disso, ce primárioll culturas tendem a adaptar-se às condições de cultura e suas propriedades de expressão de genes diferem essencialmente da situação in vivo em cima de cada passagem, mesmo durante os primeiros trechos (entre passagem 3 e 6) 7, 8. Conseguimos manter o material cirúrgico resíduos em ex vivo condições de cultivo para um período de tempo que permite o estudo das características específicas do paciente e de triagem de compostos de drogas anti-fibróticas ou anti-inflamatórios.
O sistema baseia-se numa membrana de nitrocelulose, que permite o contacto do tecido com o suporte, mas não com o plástico, assim, evitar a alteração do tecido após a fixação, como observado anteriormente, quando a cultura de fibroblastos DD, bem como outros tipos de células 9. Não é necessário um gel de colagénio ou outro substrato de proteína da MEC, desde o próprio tecido DD produz grandes quantidades dessas proteínas. Isto é vantajoso para a manutenção do microambiente ECM nativa e pecado rotatividadesubstratos de matriz ce são importante regulador da arquitetura e da função 10, 11 tecido. Por exemplo, proteínas da MEC como a fibronectina, laminina e colágeno, podem influenciar polaridade traseira e dianteira de fibroblastos como semelhante mostrados para polaridade apical-basal em células epiteliais 12, 13 . células polarizadas têm uma distribuição assimétrica de moléculas extracelulares, que determina a migração celular e a expressão do gene, por exemplo, acessibilidade integrina α1β1 na membrana afecta a adesão das células ao colagénio do tipo I 14. Desde um objetivo primário deste modelo 3D era preservar o microambiente nativa, não foi utilizado nenhum substrato matriz ECM artificial.
Em resumo: as amostras de ressecção são igualmente cortar em um ambiente estéril e colocadas em membranas nitrocellular. Se for necessário um tratamento administrado por via de injecção os tecidos são injectadas após terem sido colocados sobre a membrana. Se o tratamento não necessita de ser administrado via injec ç ã o, em seguida, o composto é adicionado ao meio de cultura (Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), com 1% de soro fetal de vitelo (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina (P / S)). As culturas são mantidas durante um período máximo de 10 dias, após o que o tecido é fixado em paraformaldeído a 4% (PFA), processados através de uma solução de sacarose a 30%, embebidos em composto PTU e armazenado a -80 ° C, como descrito anteriormente 5.
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Protocolo
Este protocolo segue as diretrizes LUMC e AMC do comitê de ética em pesquisa humana.
1. Procedimento Cirúrgico e Cobrança Tissue
Nota: Apesar de existirem várias técnicas para a excisão cirúrgica da contratura de Dupuytren, o padrão ouro atual é a facectomia parcial 15. A maioria dos doentes são tratados no dia-a cirurgia clínica.
- Realizar a cirurgia sob anestesia geral ou regional, de acordo com as preferências do paciente e anestesista e das comorbidades do paciente. Estas considerações estão fora do escopo deste artigo. Antes da incisão, tocar a pele com um objeto pontiagudo para verificar que a anestesia é satisfatória. Use um torniquete para facilitar a visualização cirúrgica em um campo sem derramamento de sangue.
- Após Prepping estéril e drapeados, marcar a incisão antecipada com uma caneta. Faça uma incisão na pele com um bisturi sob ampliação lupa ou longitudinalmente or utilizando incisões em ziguezague para impedir contraturas adicionais e também para permitir a exposição suficiente.
- Usando tesoura de dissecção, libertar a pele e subcutâneo dos subjacentes palmaris fáscia contratados. Identificar e proteger o feixe neurovascular do dedo, porque o cabo de doente pode deslocá-lo para a linha média. Uma vez que o tecido fibrótico (nódulo e / ou cabo) é delineada, extirpar, colocou e regionalmente (subtotal), utilizando um bisturi. Hemostasia meticulosa sob controlo torniquete no final do procedimento para evitar a formação de hematoma.
- Para fechar a pele, use-plasties Z adicionais para obter alongamento parcial da pele.
- Para estes estudos usar apenas a parte nódulo do cordão fibrótico, a parte mais ativa e celular da doença. Já o cirurgião realizar a identificação macroscópica. Os nódulos isolados na palma da mão são frequentemente precursores ou um cabo, mas quase nunca são ressecadas, como eles geralmente não causar sintomas.As que ressecados foram os nódulos que faziam parte de um cabo do dedo contratado. Identificar esses nódulos pela parte grossa duro das cordas no handpalm (Figura 1A).
- Uma vez que o cirurgião remove o tecido, imediatamente transferi-lo usando uma pinça estéril para um tubo de 50 ml contendo meio DMEM suplementado com FCS a 10% e 1% (P / S). Manter o tecido durante um período máximo de 2 horas neste meio em uma caixa de gelo triturado (4 ° C) (por exemplo, o transporte do tecido a partir da sala de operação para a instalação de cultura de células).
- Mantenha as amostras em gelo molhado (4 ° C) durante a preparação para a próxima etapa. Preparação de materiais da câmara de cultura de células e requer 10-20 min.
2. Preparação de Instrumentos, Meio de Cultura e Cultura Inserções
Nota: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado.
- Preparar 500 ml de DMEM suplementado com FCS a 10% e 1% (P / S) e filtro sterilize. Pré-aquecer o meio a 37 ° C.
- Fórceps autoclave, um par de tesouras Mayo curvas de lâmina (150-170 mm de comprimento) e um par de tesouras Metzenbaum e guarde em um recipiente estéril.
- Sob fluxo laminar, aberto um estéril de 12 poços da placa de cultura. Coloque uma inserção de cultura (0,45 de tamanho de poro, 12 mm de diâmetro) em cada poço da placa de 12 poços (Figura 1B, painel inferior).
- Encher a placa de 12 poços com 600 ul de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por pipetagem no bem e não directamente na membrana da pastilha. Colocar a placa na incubadora (37 ° C, 5% CO 2) (Figura 1B, painel superior).
- Em alternativa, usar uma placa de 24 poços e adicionar 300 uL de meio por poço. O volume de meio por poço é óptima quando uma camada de menisco é formado entre o líquido e a parte inferior do inserto membrana.
Nota: o meio, na parte inferior do poço difunde-se através da Membr nitroceluloseane formando a camada de menisco, como representado nos esquemas da Figura 1B (painel inferior).
- Em alternativa, usar uma placa de 24 poços e adicionar 300 uL de meio por poço. O volume de meio por poço é óptima quando uma camada de menisco é formado entre o líquido e a parte inferior do inserto membrana.
3. Tissue Setup Preparação e Ex Vivo Cultura de Tecidos
Nota: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado.
- Transferir o nódulo parte do cabo a partir do tubo de 50 ml, num prato de Petri 100 milímetros e adicionar 10 ml da pré-aquecido (37 ° C) médio. Certifique-se de que o tecido está em contacto com o líquido durante todo o procedimento.
- Retirar a camada de gordura perinodular usando a tesoura Metzenbaum. Descartar o tecido adiposo. Com a utilização de fórceps e tesouras as curvas de lâmina, cortar transversalmente o tecido em pequenos pedaços (com uma espessura máxima de 200 mm).
- Transferir a placa de 12 poços da incubadora para a capa laminar. Verificar que a membrana do inserto tornou transparente (molhado) e, por conseguinte, está em contacto com o meio.
- Utilizando uma pinçalevantar cuidadosamente uma parte do tecido por tocar na camada exterior (não aplicar tensão no tecido). Coloque uma parte do tecido para a membrana da inserção de cultura de células de modo que o tecido permanece na interfase ar-meio. Cultura um máximo de duas peças de tecido na mesma pastilha / poço.
- Certifique-se de que o tecido é colocado plana sobre a membrana, em contacto longitudinal com o meio de tal modo que o tecido não adere à membrana nem é inteiramente coberta pela mídia. Evitar bolhas de ar.
Nota: Nesta fase, é possível adicionar fatores de crescimento ou inibidores de interesse para a mídia; por exemplo, os compostos de ensaio (A, B, C, D, E) de repetições e / ou na curva de concentração. Inclua pelo menos 2 controle (sem tratamento) peças de tecido em condições normais de crescimento para garantir que a experiência tem sido configurado corretamente. Incubar tecidos para 3-7 dias numa incubadora de cultura de tecidos. - Infectar o tecido com qualquer um lentivírus ou adenovírus construção se superexpressão ou derrubar experiments de uma necessidade gene de interesse a ser realizado (Figura 2). Transferir uma parte do tecido da placa de 12 poços numa placa de 35 mm, utilizando fórceps.
- Utilizar um volume máximo de 10 ul de vírus de título elevado.
- Realizar a injecção sob um microscópio de dissecação com uma seringa de insulina carregada com 50 ul de PBS contendo 10 ul de vírus seleccionados. Inserir a agulha perpendicular ao centro do tecido.
- Lentamente injectar o conteúdo da seringa. Não retirar a agulha diretamente. Quando a perfuração do tecido, não deixe que a agulha passar pelo outro lado, mas manter a agulha dentro do próprio tecido (em torno do centro do tecido).
- Transferir o tecido de volta para a placa de 12 poços, fechar a placa de cultura e colocá-lo na incubadora (37 ° C, 5% CO 2).
4. Whole-mount Imunofluorescência Coloração e Reconstrução 3D
Nota: Todos os proprocedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado. O protocolo para immunostaining montagem toda e de imagem descritos a seguir é uma adaptação de métodos reportados anteriormente utilizados para outros tecidos 16-19. Tampões e materiais estão descritos na Tabela 1 e Lista de Materiais.
- Tecidos de transferência da placa de cultura a 2 ml microtubos contendo PBS. Lavar 2x durante 5 minutos em solução de PBS, numa plataforma rotativa. Fix tecidos em 4% tamponada PFA (1,5 ml de solução por tecido em 2 ml de tubos de microcentrífuga), O / N a 4 ° C numa plataforma rotativa.
- Remover e lavar 3x PFA em PBS durante 5 min cada.
- Desidratar tecidos por imersão em uma solução de metanol a 25% durante 2 horas à temperatura ambiente, numa plataforma rotativa. Aumentar gradualmente a percentagem de metanol (50%, 75%, 100%) com os tecidos imersos em cada solução durante 2 horas à temperatura ambiente, numa plataforma rotativa.
- Tecidos de transferência em DMSO / solução de metanol (passo permeabilização) durante 3 semanas a 4 ° C,como anteriormente descrito 18.
Nota: Nesta fase, os tecidos podem ser armazenadas a longo prazo em metanol a 100% a -20 ° C. - Prossiga com coloração procedimento 16, 17; gradualmente re-hidratar os tecidos (75% -50% -25% -0% série metanol). Executar cada etapa de re-hidratação durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C, sob agitação constante.
- Incubar as amostras com anticorpos primários em PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) e 20% de DMSO O / N a 4 ° C. Use anticorpos nas seguintes proporções utilizando as reservas comerciais em PBS: anti-α actina de músculo liso (1: 500, rato), tipo anti-colágeno I (1: 500, de cabra), anti-colágeno tipo III (1: 500, cabra).
- Lavar extensivamente em PBS durante 48 horas a 4 ° C (solução de PBS mudança de 3 a 4 vezes).
- Diluir anticorpos secundários adequados (Alexa 555 anti-ratinho, Alexa 488 anti-cabra) a 1: 250 em PBS contendo 1% (BSA) e 20% de DMSO. Incubar O / N a 4 ° C.
- Lavar extensivamente em PBS durante 48 horas a 476; C e incubar com contraste nuclear, TO-PRO-3 diluído 1: 500 em PBS no passo de lavagem final.
Nota: TO-PRO-3 é um corante vermelho-extremo emissores de ADN (com um He-Ne linha de laser 633 nm) e é combinado para imagiologia simultânea com outros canais; neste tipo de colágeno tipo caso I / colagénio III (488 nm), α actina de músculo liso (555 nm), TO-PRO-3 (647 nm). - Transferir os tecidos a uma série de metanol (25% -50% -75%) para se desidratar-se lentamente o tecido; executar cada etapa de desidratação durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C sob agitação constante.
- Tecidos de transferência em tubos de polipropileno. Tecidos claros em metilsalicilato (alça sob o capô química) 18 ou como uma alternativa de uso solução BABB 19. Incubar à temperatura ambiente, sob agitação constante até que os tecidos tornam-se transparentes. Mount entre um slide e uma lamela selado com jogo duro meio de montagem (Figura 1C, painel superior).
- Amostras de imagem em um micro confocal invertidoâmbito equipado com alta NA 63X e / ou os objectivos de imersão de óleo 100X (Figura 1C).
- Limpar a lente com a solução de limpeza fornecido pelo fabricante do microscópio.
- Aplicar uma gota de óleo sobre a lente objectiva. Coloque o slide com o modelo no palco microscópio e foco na amostra.
- Defina as configurações no microscópio para gravação simultânea de três canais de fluorescência com linhas de laser de 488 nm, 514 nm e 633 nm.
- Adquira imagens XY individuais ou várias imagens de plano focal (pilha Z) (Figura 3A). Use aumento da largura da pilha Z para executar a reconstrução 3D. Para obter uma imagem de alta resolução utilizam baixa velocidade de digitalização, número de scans médios (≥ 3) e adquirir imagens de resolução de 1.024 x 1.024 pixels de 16 bits.
- Analisar as imagens da pilha Z adquiridos: primeiro renomear e salvar arquivo de imagem (xyz). Utilizando o programa de software do microscópio confocal, configurar uma intensidade máxima projecção das imagens pilha Z em uma reconstrução 3D da imagem.
- Selecione o arquivo xyz, em "Ferramentas processo", clique em "Visualização" e "Projeção 3D". Enter "máximo" no método de projecção (ou "médio", se o sinal fluorescente é saturada). Para uma única projeção não altere o X, Y, Z e aviões, e aplicar a ferramenta de projeção (Figura 3B, R1).
- Use as imagens da pilha Z para criar uma projeção em 3D com animação (software confocal) para fins de visualização. Selecione o arquivo xyz, nas ferramentas de processo, clique em "Visualização" e "Projeção 3D".
- Clique em "Criar Filme". Digite o ângulo de iniciar a rotação em graus (por exemplo, 0 ° como ponto do filme, eixo Y de partida) e clique em "Set Start". Digite o ângulo de rotação em graus End (eixo Y), como ponto final do filme (por exemplo, 180 ° ou 3606; para uma rotação completa) e clique em "Set End".
- Escolha "Máximo" como um método de projecção (ou "médio", se o sinal fluorescente é saturada). Introduzir o "Número de Quadros" para a rotação da reconstrução 3D (por exemplo, 20 ou rotações mais elevadas para reduzir a velocidade de rotação). Clique em "Aplicar". Exportar o filme como um arquivo visual (por exemplo, "avi") (Filme Suplementar 1) ou exportar como arquivo "tiff", que cria um arquivo de imagem para cada ângulo de rotação (Figura 3B, rotação R4, R10, R18).
5. Combinada Second Harmonic Generation (colágeno) e de dois fótons de fluorescência Excited (elastina) Imagem em Tissue Ex Vivo durante Cultura
Nota: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente a menos que especificamente indicado.
- Remover placas transwell da incubadora e coloque um único (não fixo) tiparte ssue em um 35 milímetros placa de cultura celular contendo 500 mL de meio.
- Colocar o tecido de modo que o eixo longo é plana sobre a placa. Mantenha tecido molhado em todos os momentos no entanto, não flutuante.
- Coloque objectivo imerso em água do microscópio multifóton directamente em contacto com o tecido (Figura 1C).
- Obter imagens com um comprimento de onda de excitação de 800 nm e coletar luz emitida entre 371-425 nm (SHG, colágeno) e 474-532 nm (autofluorescência, elastina) (Figura 3C). Execute microscopia de dois fótons em um microscópio confocal vertical equipado com um laser de femtosegundo usando uma objetiva de imersão em água 20X / 1.0 NA. Processo confocal acumula com o software do fabricante.
Nota: Excitação com um laser infravermelho próximo de moléculas de colágeno cria alto contraste de imagem de estruturas de colágeno nativas em diferentes profundidades.
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Resultados
O método de ex vivo, a cultura 3D de tecido conjuntivo é um conjunto up sistema fácil e robusta para entender a relação entre ECM e outros componentes de células que constituem o tecido DD e potencialmente outros tipos de fibrose também. Além disso, este sistema permite que um método fiável para testar os efeitos dos compostos sobre diferentes tipos de células e os seus efeitos sobre a carga 20 fibrótica.
As etapas de coleta de resíduos de material cirúrgico derivado de f...
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Discussão
Os passos mais críticos de cultura ex vivo de tecido conjuntivo humano são o uso imediato do tecido após a remoção cirúrgica para assegurar a viabilidade; o tecido deve permanecer na solução de meio ou soro fisiológico em todos os momentos; manter uma cultura estéril; cortes transversais de tecido deve ter espessura máxima de 200 m; configurar o sistema de cultura ex vivo é óptima quando o tecido está em contacto com o suporte, mas não totalmente submerso. Meio deve ser adicionado apenas na câmara fora...
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Divulgações
Os autores entraram com um pedido de patente para a doença de Dupuytren: cultura de órgão 3D. # GB1307200. Contratos de licença e de serviços comerciais estão disponíveis.
Agradecimentos
Os autores agradecem às enfermeiras do AMC que facilitaram a coleta de tecidos. Também gostaríamos de agradecer a A.M.A. van der Laan pelo excelente suporte técnico com o SHG e a imagem de dois fótons.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| soro fetal de bezerro (FCS) | Gibco | inativada pelo calor | |
| Invitrogen | 15070-063 | ||
| Inserções de cultura de células | Millicell | PIHA01250 | 0,45 μ m tamanho do poro, 12 mm de diâmetro |
| anti-colágeno tipo I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti-&alfa; actina de músculo liso | Sigma | A2547 | |
| anti-colágeno tipo III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Anticorpo | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| metilsalicilato | Sigma | M6752 | |
| paraformaldeído | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope lamínulas de vidro | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Microscópio SuperFrost lâminas | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76 x 26 mm |
| VECTASHIELD HardSet Montagem Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Microscópio confocal Leica TCS SP5 II | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm e HeNe-633 nm linhas laser | |
| Zeiss 710 NLO microscópio confocal vertical | Jena, Alemanha | Equipado com laser Spectra - Physics Deep See MP de femtossegundos (Santa Clara, Estados Unidos) usando uma objetiva de imersão em água Plan-Apochromat 20X/1.0 NA. |
Referências
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Reimpressões e permissões
