Human Dupuytren de<em> Ex Vivo</em> Culture pour l'étude de myofibroblastes et de matrice extracellulaire Interactions

Summary

La maladie de Dupuytren (DD) est une maladie fibroproliférative de la paume de la main. Ici, nous présentons un protocole à la culture spécimens de résection de DD dans un (3D) système de culture tridimensionnelle. Ce système de culture à court terme permet la préservation de la structure 3D et propriétés moléculaires du tissu fibreux.

Abstract

Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.

To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.

As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Introduction

La maladie de Dupuytren (DD), une maladie fibroproliférative bénigne provoque la flexion des doigts permanente due à la formation de nodules et les cordons dans la paume de la main. Bien que la propagation de la maladie est particulièrement élevé chez les Caucasiens d'Europe du Nord, l'étiologie génétique sous-jacente de la maladie reste inconnue ^1. La principale caractéristique de DD est l'excès de production de matrice extracellulaire (ECM) protéines (par exemple, collagène), qui forment un tissu fibreux dur occupant l'espace entre les tendons et la peau de la paume de la main et des doigts, ce qui perturbe de façon permanente les mouvements fins de la main ^{2, 3.} La récurrence de la maladie suggère altérations génétiques sous-jacents comme une cause de la fibrose ^{1, 4.} Un traitement efficace pourrait être de cibler directement les mécanismes fibrotiques incontrôlables au niveau cellulaire et moléculaire.

Notre travail récent sur la fibrose nous a conduit à l'élaboration d'unnouveau système de culture en 3D qui permet la culture à court terme de tissu fibreux humain avec le potentiel de dépistage des drogues. Ce système a contribué à surmonter l'approche limite de cultures de fibroblastes 2D et de définir un rôle pour la régulation à la baisse partielle, réalisée par le saut d'exon, d'activation de la voie TGF dans la médiation de la fibrose ^5.

Nous avons développé une méthode à la culture ex vivo pièces d'exérèse humaine de patients DD pour étudier l'interaction entre les myofibroblastes et l'ECM entourant ^{5, 6.} L'étude de DD fibrose du tissu conjonctif ainsi que d'autres maladies fibrotiques se appuie sur l'analyse histopathologique de l'excisée chirurgicale spécimens, l'isolement des fibroblastes du tissu et l'établissement de cultures primaires ou de procédures de triage des cellules. Ces approches sont assez statique, car ils ne permettent pas la manipulation exogène des propriétés de la maladie ou une intervention thérapeutique par l'expérimentateur. En outre, CE primairecultures ll ont tendance à se adapter aux conditions de culture et de leurs propriétés d'expression des gènes diffèrent essentiellement de la situation in vivo sur tous les passages, même pendant les premiers passages (parmi passage 3 et 6) ^{7, 8.} Nous avons réussi à maintenir le matériel chirurgical des déchets ex vivo conditions de culture pour une période de temps qui permet l'étude des caractéristiques spécifiques du patient et le criblage de composés médicamenteux anti-fibrotiques ou anti-inflammatoires.

Le système est basé sur une membrane de nitrocellulose qui permet un contact du tissu avec le milieu, mais pas avec la matière plastique, par conséquent, la prévention de l'altération du tissu lors de la fixation, comme observé précédemment lors de la mise en culture de fibroblastes de DD ainsi que d'autres types de cellules ^9. Aucun gel de collagène ou d'un autre substrat de protéine ECM est nécessaire, étant donné que le tissu DD se produit de grandes quantités de ces protéines. Ce est avantageux pour l'entretien des micro ECM natif et le chiffre d'affaires le péchédes substrats à matrice CE sont régulateur important de l'architecture et de la fonction ^{10, 11} tissus. Par exemple, les protéines de la MEC telles que la fibronectine, la laminine et le collagène, peuvent influencer polarité avant-arrière de fibroblastes indiqués comme similaire à polarité apicale-basale dans les cellules epitheliales ^{12, 13} . cellules polarisées ont répartition asymétrique des molécules extracellulaires qui détermine la migration cellulaire et l'expression des gènes, par exemple, l'accessibilité de l'intégrine α1β1 sur la membrane affecte l'adhérence cellulaire de collagène de type I ^14. Etant donné que l'objectif principal de ce modèle 3D a été de préserver le micro-environnement natif, aucune substrat de matrice ECM artificielle a été utilisée.

En bref: pièces d'exérèse sont également coupés dans un environnement stérile et placés sur des membranes nitrocellular. Si le traitement administré par injection est nécessaire, les tissus sont injectés après qu'ils ont été placés sur la membrane. Si le traitement ne nécessite pas d'être administrés par injection puis le composé est ajouté au milieu de culture (milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), avec 1% de sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine (P / S)). Les cultures sont maintenues pendant un maximum de dix jours, après quoi le tissu est fixé à 4% de paraformaldehyde (PFA), traité par une solution de saccharose à 30%, noyé dans du composé OCT et stocké à -80 ° C, comme décrit précédemment ^5.

Protocol

Ce protocole suit les directives LUMC et AMC de comité d'éthique de la recherche humaine. 1. Procédure chirurgicale et collecte de tissus Remarque: Bien qu'il existe différentes techniques pour l'excision chirurgicale de la maladie de Dupuytren, l'étalon-or actuel est le fasciectomie partielle 15. La plupart des patients sont traités dans la clinique chirurgie d'un jour. Effectuer la chirurgie sous anesthésie gén?…

Representative Results

La méthode de l'ex vivo, la culture 3D de tissu conjonctif est un ensemble en place un système robuste et facile à comprendre la relation entre l'ECM et les autres composants de cellules constituant le tissu DD et potentiellement d'autres types de fibrose ainsi. En outre, ce système permet une méthode fiable pour tester les effets de composés sur différents types de cellules et de leurs effets sur la charge fibrotique 20. Les étapes de la collection de…

Discussion

Les étapes les plus critiques de la culture ex vivo du tissu conjonctif humain sont l'utilisation immédiate du tissu après l'ablation chirurgicale pour assurer la viabilité; le tissu doit rester en solution à moyen ou une solution saline en tout temps; maintenir une culture stérile; des coupes transversales de tissu doivent avoir une épaisseur maximale de 200 um; mise en place du système ex vivo de culture est optimale lorsque le tissu est en contact avec le milieu, mais non totalement …

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Invitrogen	11965-084
fetal calf serum (FCS)	Gibco		high glucose, heat inactivated
penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Cell culture inserts	Millicell	PIHA01250	0.45um pore size, 12mm diameter
anti-collagen type I	Southern Biotech	1310-08
anti- α smooth muscle actin	Sigma	A2547
anti-collagen type III	Southern Biotech	1330-01
Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A-31570
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody	Invitrogen	A-11055
TOPRO-3	Invitrogen	T3605
methylsalicylate	Sigma	M6752
paraformaldehyde	Sigma	P6148
Tissue Tek OCT	Sakura	25608-930
Microsccope glass coverslips	Menzel-Glaser	BB024060A1	24x60mm
Microscope SuperFrost slides	Menzel-Glaser	AA00000102E	76x26mm
VECTASHIELD HardSet Mounting Medium	Vector laboratories	H-1400
Leica TCS SP5 II confocal microscope	Leica Microsystems		Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines
Zeiss 710 NLO upright confocal microscope	Jena, Germany		equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective.