Menschen Dupuytren'sche<em> Ex vivo</em> Kultur für das Studium der Myofibroblasten und extrazellulären Matrix-Interaktionen
Summary
Morbus Dupuytren (DD) ist ein fibroproliferative Erkrankung der Handfläche der Hand. Hier stellen wir ein Protokoll zur Kultur Resektionsproben aus DD in einem dreidimensionalen (3D) Kultur-System. Solche Kurzzeitkultur-System ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und molekularen Eigenschaften des fibrotischen Gewebe.
Abstract
Organ fibrosis or “scarring” is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells.
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first “organ” culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.
Introduction
Dupuytren-Krankheit (DD), bewirkt eine gutartige fibroproliferative Krankheit Permanent Beugung der Finger aufgrund der Bildung von Knötchen und Leitungen in der Handfläche der Hand. Obwohl die Krankheit verbreitet ist besonders hoch bei Kaukasiern in Nordeuropa, die zugrunde liegenden genetischen Ursache der Erkrankung ist unbekannt 1. Das Hauptmerkmal der DD ist die Überproduktion von extrazellulärer Matrix (ECM), Proteine (zB Kollagen), die den Raum zwischen den Sehnen und Haut der Handfläche der Hand und der Finger besetzen eine harte Fasergewebe zu bilden, die feinen Bewegungen dauerhaft gestört der Hand 2, 3. Die Wiederauftreten der Krankheit schlägt zugrunde liegenden genetischen Veränderungen als Ursache der Fibrose 1, 4. Eine wirksame Behandlung sein könnte, um direkt zielen auf die unkontrollierbare fibrotische Mechanismen auf zellulärer und molekularer Ebene.
Unsere jüngsten Arbeiten zur Fibrose hat uns zur Entwicklung einer LED-neuartigen 3D Kultursystem, das Kurzzeitkultur der menschlichen fibrotischen Gewebes, die das Potenzial von Drogentests ermöglicht. Dieses System hat dazu beigetragen, die einschränkender Versuch 2D Fibroblastenkulturen zu überwinden und eine Rolle zum teilweisen Abregulation durch Exon-Skipping erreicht, von TGFß Stoffwechselwegaktivierung der Vermittlung Fibrose 5 definieren.
Wir haben ein Verfahren zur ex vivo-Kultur menschlicher Resektionsproben aus DD-Patienten, die Wechselwirkung zwischen Myofibroblasten und der umgebenden ECM 5, 6 studieren entwickelt. Das Studium der DD Bindegewebe Fibrose sowie anderer fibrotischer Erkrankungen beruht auf histopathologische Analyse des ausgeschnittenen chirurgischen Proben, Isolation von Fibroblasten aus dem Gewebe und Etablierung von Primärkulturen oder Zellsortierverfahren. Diese Ansätze sind ziemlich statisch, da sie exogener Manipulation der Krankheit Eigenschaften oder therapeutischen Intervention vom Experimentator nicht zulassen. Außerdem primären cell Kulturen neigen dazu, zu den Kulturbedingungen anpassen und ihre Genexpression Eigenschaften unterscheiden sich im Wesentlichen aus der in vivo Situation bei jedem Durchgang, auch während der frühen Passagen (unter Durchgang 3 und 6) 7, 8. Es ist uns gelungen, den Abfall chirurgisches Material in zu erhalten Ex-vivo-Kulturbedingungen für eine Zeitdauer, die Studie über die patientenspezifische Eigenschaften und das Screening von anti-fibrotische oder entzündungshemmende Medikament Verbindungen ermöglicht.
Das System wird auf eine Nitrocellulosemembran, die einen Kontakt des Gewebes mit dem Medium, jedoch nicht mit dem Kunststoff ermöglicht somit die Verhinderung der Veränderung des Gewebes bei der Befestigung, wie zuvor beobachtet, wenn die Kultivierung DD Fibroblasten sowie andere Zelltypen 9 basiert. Kein Kollagengel oder andere ECM-Protein Substrat erforderlich, da die DD Gewebe selbst produziert große Mengen dieser Proteine. Dies ist für die Erhaltung der nativen ECM-Mikroumgebung und Umsätze sin vorteilhaftce Matrix Substrate sind wichtiger Regulator der Gewebearchitektur und Funktion 10, 11. Zum Beispiel ECM Proteine, wie Fibronectin, Laminin und Kollagen kann von vorne nach hinten Polarität Fibroblasten ähnlich für apikal-basal Polarität in Epithelzellen 12 gezeigt, 13 beeinflussen . polarisierte Zellen haben asymmetrische Verteilung der extrazellulären Moleküle, die Zellmigration und Genexpression, zB α1β1 Integrin Zugänglichkeit auf die Membran wirkt Zelladhäsion an Kollagen Typ I 14 bestimmt. Da ein Hauptziel dieses 3D-Modell war es, die einheimischen Mikroumgebung zu erhalten, wurde keine künstlichen ECM Matrixsubstrat verwendet.
Kurz: Resektion Proben sind gleichmäßig in einer sterilen Umgebung abgeschnitten und auf nitrocellular Membranen gelegt. Wenn die Behandlung mittels Injektion verabreicht wird benötigt das Gewebe injiziert werden, nachdem sie auf der Membran platziert. Wenn die Behandlung nicht benötigen, um über inj verwaltet werdenection dann wird die Verbindung zu dem Kulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 1% fötalem Kälberserum (FCS), 1% Penicillin-Streptomycin (P / S)) zugefügt. Die Kulturen werden für höchstens zehn Tage nach dem das Gewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA) fixiert, durch 30% Saccharose-Lösung verarbeitet werden, in OCT-Verbindung eingebettet und bei -80 ° C gelagert gehalten, wie zuvor beschrieben 5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die kritischsten Schritte der Kultivierung ex vivo menschlichen Bindegewebes sind die sofortige Verwendung des Gewebes nach der operativen Entfernung der Rentabilität zu gewährleisten; Das Gewebe sollte in Medium oder Kochsalzlösung zu jeder Zeit bleiben; Aufrechterhaltung einer sterilen Kultur; Querschnitten von Gewebe sollte maximal 200 & mgr; m Dicke zu haben; Einrichten der Ex-vivo-Kultursystem ist optimal, wenn Gewebe in Kontakt mit dem Medium, aber nicht vollständig untergetaucht. Medium …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 11965-084 | |
| fetal calf serum (FCS) | Gibco | high glucose, heat inactivated | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Cell culture inserts | Millicell | PIHA01250 | 0.45um pore size, 12mm diameter |
| anti-collagen type I | Southern Biotech | 1310-08 | |
| anti- α smooth muscle actin | Sigma | A2547 | |
| anti-collagen type III | Southern Biotech | 1330-01 | |
| Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A-31570 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody | Invitrogen | A-11055 | |
| TOPRO-3 | Invitrogen | T3605 | |
| methylsalicylate | Sigma | M6752 | |
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Tissue Tek OCT | Sakura | 25608-930 | |
| Microsccope glass coverslips | Menzel-Glaser | BB024060A1 | 24x60mm |
| Microscope SuperFrost slides | Menzel-Glaser | AA00000102E | 76x26mm |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector laboratories | H-1400 | |
| Leica TCS SP5 II confocal microscope | Leica Microsystems | Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines | |
| Zeiss 710 NLO upright confocal microscope | Jena, Germany | equipped with femtosecond Spectra – Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA water-immersion objective. |
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