Kontrastforsterket ultralyd Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow i Experimental ryggmargsskade

Summary

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Abstract

Redusert ryggmarg blodstrøm (SCBF) (dvs. iskemi) spiller en nøkkelrolle i traumatisk ryggmargsskade (SCI) patofysiologi og er derfor et viktig satsingsområde for nervecellene terapi. Selv om flere teknikker har blitt beskrevet å vurdere SCBF, de alle har betydelige begrensninger. For å overvinne den sistnevnte, foreslår vi bruk av sanntidskontrastforsterket ultralyd imaging (CEU). Her beskriver vi anvendelse av denne teknikk i en rottemodell av contusion SCI. En hals kateter implanteres først for en gjentatt injeksjon av kontrastmiddel, en natriumklorid-oppløsning av svovelheksafluorid innkapslede mikrobobler. Ryggraden blir deretter stabilisert med en skreddersydd 3D-ramme og ryggmarg dura mater er utsatt av en laminektomi ved ThIX-ThXII. Ultralydsonden blir deretter plassert i den bakre del av dura mater (belagt med ultralyd gel). For å vurdere baseline SCBF, en enkelt intravenøs injeksjon (400 mikroliter) av contrast middel påføres for å registrere dens passering gjennom intakte ryggmargen mikrovaskulaturen. En vekt-slipp-enheten blir deretter brukt til å generere en reproduserbar modell for eksperimentell contusion SCI. Kontrastmiddel reinjiseres 15 min etter skaden å vurdere post-SCI SCBF endringer. CEU tillater sanntids og in-vivo-vurdering av SCBF endringer følgende SCI. I uskadet dyr, ultralydavbildning viste ujevn blodstrøm langs intakt ryggmargen. Videre 15 min post-SCI, var kritisk iskemi i nivå med skjelv mens SCBF forble bevart i de mer fjerntliggende områder intakt. I regionene ved siden av skjelv (både rostralt og caudal), ble SCBF betydelig redusert. Dette svarer til den tidligere beskrevne "ischemisk penumbra sone". Dette verktøyet er av stor interesse for å vurdere effekten av behandling for å begrense iskemi og den resulterende vevsnekrose etterkant SCI.

Introduction

Traumatisk ryggmargsskade (SCI) er en ødeleggende tilstand som fører til betydelig svekkelse i motor, sensoriske og autonome funksjoner. Til dags dato har ingen terapi demonstrert sin effektivitet hos pasienter. For en slik grunn er det viktig å identifisere nye teknikker som vil forbedre vurdering av potensielle behandlinger, og kan ytterligere belyse skade pathiophysiology ^1.

SCI er delt i to faser i rekkefølge, referert til som primære og sekundære skader. Den primære skaden tilsvarer den initiale mekaniske fornærmelse. Mens de sekundære skade grupper en kaskade av ulike biologiske hendelser (for eksempel betennelse, oksidativt stress og hypoksi) som ytterligere bidrar til progressiv utvidelse av den opprinnelige lesjon, vevsskade og derfor nevrologisk underskudd ^2,3.

I den akutte fase av SCI, er nevrobeskyttende terapier rettet mot å redusere den sekundære skaden patologi og shOuld følgelig bedre nevrologiske utfall. Blant de mange sekundære skadehendelser, spiller iskemi en avgjørende rolle ^4,5. På nivået av SCI episenteret, de skadede parenkymceller microvessels hindre effektiv ryggmarg blodstrøm (SCBF). Videre er SCBF også betydelig redusert i den region som omgir skaden skjelv, et område som er spesielt kjent som "ischemiske penumbra sone". Hvis SCBF ikke kan raskt gjenopprettet innen disse områdene, kan iskemi føre til tilleggs parenchymal nekrose og videre nervøs vevsskade. Som selv den minste vev bevaring kan ha betydelige effekter av funksjon, er det av stor interesse å utvikle medisiner og behandlinger som kan redusere iskemi post-SCI. For å markere dette fenomenet, har tidligere arbeid vist at bevaring av bare 10% av myelinerte axoner var nok til at gang i katter post-SCI ^6.

Selv om flere metoder er blitt beskrevet for å vurdere SCBF, deny alle har betydelige begrensninger. For eksempel, bruk av radioaktive sfærer ^7,8 og C14-iodopyrine autoradiography ⁹ krever påfølgende dyreoffer og kan ikke gjentas ved senere tidspunkter. Hydrogen klaring teknikk ¹⁰ avhenger av innsettingen av intraspinal elektroder og kan videre skade på ryggmargen. Mens laser Doppler, photoplethysmography ^14,15 og in-vivo lysmikroskopi ¹⁶ har en svært begrenset dybde / område måle ^11-13.

Vårt lag har tidligere vist at kontrastforsterket ultralyd (CEU) avbildning kan brukes til å vurdere sanntid og in-vivo SCBF endringer i rotteryggmarg parenchyma ^17. Det er viktig å merke seg at en lignende teknikk ble anvendt av Huang et al. I et grisemodell SCI ^18. CEU gjelder en bestemt modus av ultralydavbildning som gjør det mulig å knytte gråtoner morfologisk imaldre (oppnådd ved den konvensjonelle B-modus) med romlig fordeling av blodstrøm ^19. Den SCBF avbildning og kvantifisering er avhengig av intravaskulær injeksjon av kontrastmiddel for ultralyd. Kontrastmiddelet består av svovelheksafluorid mikrobobler (gjennomsnittlig diameter på omtrent 2,5 um og 90% har en diameter mindre enn 6 um) stabilisert av fosfolipider. Mikroboblene reflekterer ultralydstrålen som sendes ut av sonden og dermed forsterke blod ekkogenisitet og øke kontrasten av vevet i henhold til deres blodstrøm. Det er derfor mulig å vurdere blodstrømmen i et gitt område av interesse i henhold til intensiteten av det reflekterte signal. Mikroboblene er også trygt og de har vært anvendt klinisk i mennesker. Den svovelheksafluorid er raskt ryddet (gjennomsnittlig terminal halveringstid er 12 min), og mer enn 80% av gitt svovelheksafluorid gjenvinnes i utåndingsluften innen 2 minutter etter injeksjon. Denne protokollen er en enkel måte å bruke CEU imaldring å vurdere SCBF endringer i rotte.

Protocol

MERK: De metodene som er beskrevet i dette manuskriptet ble godkjent av bioetikk komité av Lariboisière School of Medicine, Paris, Frankrike (CEEALV / 2011-08-01). 1. Instrument Forberedelse Forberede og rense følgende instrumenter for kateterinnleggelse: Micro-tang, mikro-saks, mikro-vascular klemme, store sakser, kirurgisk tråd (Svart flettet silke 4-0) og en 14 G kateter. Heparinisere kateteret med en heparin-løsning (5000 U / ml). Forberede og rense følgende in…

Representative Results

Med den protokoll som er beskrevet ovenfor, er det mulig å kartlegge SCBF langs en langsgående ryggmarg sagittal segment. I det intakte ryggmargen, synes det å være SCBF uregelmessigheter innenfor parenchyma (figur 12). Dette kan forklares ved den variable fordelingen av radiculo-medullær arterier (RMA) fra ett dyr til et annet. RMA refererer til segmental arterier som når fremre spinal arterie (ASA) og derfor gi blodtilførselen til ryggmargen parenkym. I motsetning t…

Discussion

Selv om vi har beskrevet hvordan du skal bruke CEU i en rotte SCI kontusjon modellen, kan denne protokollen bli endret for å passe andre eksperimentelle mål eller SCI-modeller. Vi har valgt å måle SCBF bare to tidspunkter (før skade, og 15 min post-SCI), men antallet tidspunkter og forsinkelsen mellom SCBF målinger kan tilpasses for å oppfylle behovene til andre studier. For eksempel, i vårt tidligere arbeid ^17, har vi målt SCBF på fem suksessive tidspunkter i løpet av den første timen etter SCI. …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company		Comments/Description
External Fixator Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe
Toshiba Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		Ultrasound machine
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		Contrast agent : microbubbles
Vueject pump	Bracco, Milan, Italy		Electric pump for infusion of microbubbles bolus
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		Isoflurane used for anesthesia
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		Software used for quantification of spinal cord blood flow
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		Set of pliers for Do-it-yourself job