Contraste mejorado las imágenes por ultrasonido para la Evaluación de la Médula Espinal flujo sanguíneo en Experimental Spinal Cord Injury
Summary
Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.
Abstract
Flujo reducido de sangre de la médula espinal (SCPF) (es decir, isquemia) desempeña un papel clave en la lesión medular traumática (SCI) fisiopatología y en consecuencia es un objetivo importante para las terapias neuroprotectoras. Aunque varias técnicas se han descrito para evaluar SCPF, todos ellos tienen limitaciones significativas. Para superar este último, se propone la utilización de imágenes de contraste mejorado de ultrasonido en tiempo real (CEU). Aquí se describe la aplicación de esta técnica en un modelo de rata de la contusión SCI. Un catéter yugular se implanta primero para la inyección repetida de agente de contraste, una solución de cloruro de sodio de hexafluoruro de azufre microburbujas encapsuladas. La columna vertebral se estabiliza luego con un 3D-marco a medida y la médula espinal duramadre está expuesto por una laminectomía en Thix-ThXII. La sonda de ultrasonido se coloca entonces en el aspecto posterior de la duramadre (recubierta con gel de ultrasonido). Para evaluar SCPF línea de base, una sola inyección intravenosa (400 l) de contraagente st se aplica para registrar su paso a través de la microvasculatura de la médula espinal intacta. Un dispositivo de peso soltar se utiliza posteriormente para generar un modelo experimental reproducible contusión de SCI. Agente de contraste se re-inyecta 15 min después de la lesión para evaluar los cambios post-SCI SCPF. CEU permite en tiempo real e in-vivo evaluación de los cambios SCPF siguiente SCI. En el animal está sano, la ecografía mostró flujo sanguíneo irregular a lo largo de la médula espinal intacta. Además, 15 min después de la SCI, hubo isquemia crítica en el nivel del epicentro SCPF mientras permaneció conserva en las zonas más remotas intacto. En las regiones adyacentes al epicentro (tanto rostral y caudal), SCPF se redujo significativamente. Esto corresponde a la descrita previamente "zona de penumbra isquémica". Esta herramienta es de gran interés para la evaluación de los efectos de las terapias destinadas a limitar la isquemia y la necrosis tisular resultante después de la SCI.
Introduction
Lesión medular traumática (SCI) es una enfermedad devastadora que conduce a un deterioro significativo de motor, sensorial y funciones autónomas. Hasta la fecha, ninguna terapia ha demostrado su eficacia en los pacientes. Por tal razón, es importante identificar las nuevas técnicas que mejoren la evaluación de los posibles tratamientos y puede aclarar aún más pathiophysiology lesiones 1.
SCI se divide en dos fases secuenciales, que se refiere a las lesiones como primarios y secundarios. La lesión primaria corresponde al insulto mecánica inicial. Considerando que los grupos de lesiones secundarias una cascada de varios eventos biológicos (tales como la inflamación, el estrés oxidativo y la hipoxia) que contribuyen más a la expansión progresiva de la lesión inicial, daños en los tejidos y, por tanto, 2,3 déficit neurológico.
En la fase aguda de la lesión medular, terapias neuroprotectoras están dirigidas a reducir la patología lesión secundaria y shen consecuencia ould mejorar los resultados neurológicos. Entre los muchos eventos de lesiones secundarias, isquemia desempeña un papel 4,5 crucial. En el nivel del epicentro SCI, los microvasos del parénquima dañados impiden el flujo de sangre de la médula espinal efectiva (SCPF). Por otra parte, SCPF también se reduce significativamente en la región que rodea el epicentro lesión, un área específicamente conocida como la "zona de penumbra isquémica". Si SCPF no se puede restaurar rápidamente dentro de estas regiones, la isquemia puede conducir a la necrosis del parénquima suplementario y daños en los tejidos más nervioso. Como incluso la preservación de tejido más ligero puede tener efectos sustanciales de la función, es de gran interés para el desarrollo de fármacos y terapias que pueden reducir la isquemia post-SCI. Para poner de relieve este fenómeno, el trabajo previo ha demostrado que la preservación de sólo el 10% de los axones mielinizados fue suficiente para permitir caminar en los gatos después de la SCI 6.
Aunque varias técnicas se han descrito para evaluar SCPF, lay todos tienen limitaciones significativas. Por ejemplo, el uso de microesferas radioactivas 7,8 y C14-iodopyrine autorradiografía 9 requiere el sacrificio de animales posterior y no puede repetirse a posteriores puntos de tiempo. La técnica de limpieza de hidrógeno al 10 depende de la inserción de electrodos intraespinales, que pueden dañar aún más la médula espinal. Mientras Doppler láser, fotopletismografía 14,15 e in vivo microscopía de luz 16 tiene una profundidad muy limitada / zona de medida 11-13.
Nuestro equipo ha demostrado previamente que un mayor contraste de ultrasonidos de formación de imágenes (CEU) se puede utilizar para evaluar en tiempo real e in vivo los cambios SCPF en el parénquima de la médula espinal de rata 17. Es importante señalar que una técnica similar se aplicó por Huang et al., En un modelo porcino de SCI 18. CEU se aplica un modo específico de imágenes de ultrasonido que permite asociar im morfológica de escala de grisesedades (obtenidos por el modo B convencional) con la distribución espacial del flujo de sangre 19. La imagen SCPF y cuantificación se basa en la inyección intravascular de agentes de eco-contraste. El agente de contraste está compuesto de microburbujas de hexafluoruro de azufre (diámetro de significar sobre 2,5 micras y 90% tienen un diámetro inferior a 6 micras) estabilizada por fosfolípidos. Las microburbujas reflejan el haz de ultrasonido emitido por la sonda mejorando así la ecogenicidad de la sangre y el aumento de contraste de los tejidos en función de su flujo sanguíneo. Por tanto, es posible evaluar el flujo sanguíneo en una región determinada de interés según la intensidad de la señal reflejada. Las microburbujas también son seguros y que se han aplicado clínicamente en seres humanos. El hexafluoruro de azufre se elimina rápidamente (media vida media terminal es de 12 min) y más de 80% de la hexafluoruro de azufre administrada se recuperó en el aire exhalado dentro de 2 min después de la inyección. Este protocolo proporciona una forma sencilla de utilizar CEU imenvejecimiento para evaluar los cambios en SCPF rata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque hemos descrito cómo utilizar CEU en un modelo de rata contusión SCI, este protocolo puede ser modificado para adaptarse a otros objetivos experimentales o modelos SCI. Hemos elegido para medir SCPF a sólo dos puntos de tiempo (antes de la lesión y 15 minutos después de la SCI), sin embargo el número de puntos de tiempo y el retraso entre las medidas SCPF se pueden adaptar para satisfacer las necesidades de los otros estudios. Por ejemplo, en nuestro trabajo anterior 17, hemos medido SCPF en cinco…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Stephanie Gorgeard, Thierry Scheerlink (Toshiba France), and Christophe Lazare (Bracco France).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Comments/Description | |
| External Fixator Hoffman 3 | Stryker, Kalamazoo, USA | Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe | |
| Toshiba Applio | Toshiba, Tokyo, Japan | Ultrasound machine | |
| Sonovue | Bracco, Milan, Italy | Contrast agent : microbubbles | |
| Vueject pump | Bracco, Milan, Italy | Electric pump for infusion of microbubbles bolus | |
| Aquasonic Ultrasound Gel | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves | |
| Isovet | Piramal Healthcare, Mumbai, India | Isoflurane used for anesthesia | |
| Ultra Extend | Toshiba, Tokyo, Japan | Software used for quantification of spinal cord blood flow | |
| Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6 | Canadian Tire, Toronto, Canada | Set of pliers for Do-it-yourself job |
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