Hematopoietic सेल की स्वचालित मात्रा - Undecalcified अस्थि के histological छवियाँ में stromal सेल सहभागिता
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
Confocal माइक्रोस्कोपी ऐसे अस्थि मज्जा के रूप में जटिल ऊतकों के भीतर अनेक प्रकार की कोशिकाओं का स्थानीयकरण के विश्लेषण के लिए पसंद की विधि है। कई मामलों में यह इस प्रकार एक करदाता पर निर्भर पूर्वाग्रह शुरू करने और interrater विश्वसनीयता को कम करने का जोखिम असर, मैनुअल गिनती पर निर्भर करता है लेकिन, जैसा कि सेलुलर स्थानीयकरण के विश्लेषण और मात्रा का ठहराव, मुश्किल है। सेल प्रकार उनकी घटना की आवृत्ति में दृढ़ता से भिन्न है, खासकर जब इसके अलावा, यह यादृच्छिक स्थिति से दो कोशिकाओं के परिणाम के बीच सह स्थानीयकरण न्यायाधीश कि क्या अक्सर मुश्किल होता है। इधर, अस्थि मज्जा में सेलुलर सह स्थानीयकरण की निष्पक्ष मात्रा का ठहराव के लिए एक विधि शुरू की है। प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा सहित पूरे murine लंबी हड्डियों के histological वर्गों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल नमूना तैयार है, साथ ही धुंधला प्रोटोकॉल और उच्च संकल्प छवियों के अधिग्रहण का वर्णन है। हिमेटोपोयटिक और गैर hemat की मान्यता से फैले विश्लेषण से कार्यप्रवाहउन कोशिकाओं के बीच सीधे संपर्क की मात्रा का ठहराव के लिए दो-आयामी (2 डी) अस्थि मज्जा छवियों में opoietic सेल प्रकार प्रस्तुत किया है। यह भी एक निश्चित सेल प्रकार आसपास के सेलुलर microenvironment के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, एक पड़ोस विश्लेषण भी शामिल है। दो प्रकार की कोशिकाओं के सह स्थानीयकरण यादृच्छिक सेल स्थिति के मात्र नतीजा है या कोशिकाओं के बीच तरजीही संघों को दर्शाता है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए आदेश में, hematopoietic के रूप में अच्छी तरह से stromal कोशिकाओं के मामले में इस परिकल्पना के परीक्षण के लिए उपयुक्त है जो एक सिमुलेशन उपकरण है, उपयोग किया गया। यह दृष्टिकोण अस्थि मज्जा तक सीमित नहीं है, और histological डेटा की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति के लिए अन्य ऊतकों के लिए बढ़ाया जा सकता है।
Introduction
कारण ऑप्टिकल इमेजिंग सहित माइक्रोस्कोपी में हाल ही में तेजी से तकनीकी विकास करने के लिए, पूरे ऊतक के संदर्भ में कोशिकाओं का विश्लेषण प्रतिरक्षण के लिए तेजी से सुलभ हो गया है। निलंबन में एकल कक्षों के लक्षण वर्णन सेलुलर और आणविक समारोह को समझने के लिए एक मूल्यवान और अपरिहार्य विधि का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, उनके (माइक्रो) -anatomical पर्यावरण के भीतर कोशिकाओं के विश्लेषण में इस तरह के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विकास के रूप में जटिल प्रक्रियाओं में सहयोग करने वाले विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत को समझने के लिए आवश्यक है।
Microscopists छवियों से गुणात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए यह अपेक्षाकृत आसान है, यह आंशिक रूप से की वजह से इस क्षेत्र में विश्लेषण के तरीकों छवि अधिग्रहण में क्या हो सकता है की तुलना में पिछड़ रहे हैं, सच है कि इन आंकड़ों यों के लिए एक चुनौती बनी हुई है। कई शोधकर्ताओं अभी भी समय लेने वाली उनकी ऊतक विज्ञान छवियों में मार्गदर्शन सेल गिनती पर भरोसाइस प्रकार विभिन्न रेटर के बीच एक पूर्वाग्रह शुरू करने और अन्य समूहों द्वारा प्रतिकृति निरोधक। आमतौर पर, एक प्रतिनिधि छवि यह मुश्किल पाठक एक ऐसी घटना के सांख्यिकीय प्रासंगिकता न्याय करने के लिए कर रही है, एक प्रकाशन में सेलुलर स्थिति या सह स्थानीयकरण पर एक बयान को रेखांकित करने के लिए चुना है।
साथ में छवि डेटा की पूरी जानकारी सामग्री शायद ही कभी शोषण किया जाता है कि इस तथ्य के साथ, यह एक और अधिक तेज, निष्पक्ष और व्यापक दृष्टिकोण ऊतकीय छवियों का विश्लेषण करने के लिए की जरूरत पर जोर दिया।
अस्थि मज्जा वयस्क रीढ़ में hematopoiesis की अंग के रूप में महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण कार्यों पर ले जाता है जो एक जटिल ऊतक है। Hematopoietic कोशिकाओं 1,2 के लिए जन्मस्थान होने और बी लिम्फोसाइट विकास तीन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है इसके अलावा, यह भी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं 4 शुरू की और परिपक्व, रीसर्क्युलेटिंग बी कोशिकाओं 5 का समर्थन कर रहे हैं, जहां एक साइट के रूप में कार्य करता है। मैं बनाए रखने में इसके अलावा, अपनी भूमिकाप्रतिरक्षा स्मृति गठन कोशिकाओं के कई प्रकार के 6-9 वहाँ निवास करने के लिए पाया गया है के रूप में mmunological स्मृति तेजी से पिछले दशक में सराहना हो गया है।
जटिल ऊतक अस्थि मज्जा की वास्तुकला और अपने कार्यों के बीच संबंध अभी भी मायावी रहते हैं। ऐसी टी और बी सेल क्षेत्रों के रूप में मैक्रो-डिब्बों में आयोजन किया जाता है, जो माध्यमिक ल्य्म्फोइड अंगों के विपरीत, अस्थि मज्जा एक स्पष्ट मैक्रो-compartmentalization का अभाव है। अब तक अस्थि मज्जा में अलग डिब्बों हड्डी कॉर्टेक्स करने के लिए या vasculature को उनकी निकटता से परिभाषित कर रहे हैं। इस तरह का समर्थन स्टेम सेल, बी कोशिकाओं या इस तरह लंबे समय रहते प्लाज्मा कोशिकाओं (पीसी के रूप में प्रतिरक्षा स्मृति सेल आबादी (के रखरखाव), सीडी 4 + और के विकास के रूप में प्रक्रियाओं के एक नंबर के लिए अस्थि मज्जा में विभिन्न निवासी स्ट्रोमल सेल आबादी का महत्व सीडी 8 + स्मृति टी कोशिकाओं) स्पष्ट रूप से अस्थि मज्जा में सूक्ष्म compartmentalization की एक निश्चित डिग्री है कि वहाँ इंगित करता है।
<pवर्ग = "jove_content"> इन टिप्पणियों निश्चित कार्यक्षमताओं अस्थि मज्जा में (सेल रखरखाव, विभिन्न चरणों में बी सेल विकास, और प्रतिरक्षाविज्ञानी स्मृति के रखरखाव स्टेम) में विशेष कर रहे हैं, जो अलग microanatomical आलों, की अवधारणा के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। विभिन्न कार्यों की सेवा niches कि बीच में विविधता की एक निश्चित डिग्री हो रहा है हालांकि, इस तरह के CXC-केमोकाइन ligand के 12 (CXCL12) या इंटरल्यूकिन 7 (आईएल 7), के रूप में stromal कोशिकाओं द्वारा निर्मित कारकों में से कुछ के लिए महत्वपूर्ण घटक हैं इन आलों 10 में से कई। अस्थि मज्जा में दृश्य और stromal कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के कारण लंबे, पतले वृक्ष के समान एक्सटेंशन अस्थि मज्जा भर में एक नेटवर्क बनाने के साथ अपने रूपात्मक सुविधाओं के लिए मुश्किल है, और उपयुक्त मार्कर की कमी स्ट्रोमल उप-जनसंख्या भेदभाव करने के लिए।इन आलों उनके सेलुलर और आणविक compositio के लिए सम्मान के साथ आम सुविधाओं को साझा किस हद तक यह अभी तक के रूप में स्पष्ट नहीं हैएन, और तत्व है जो एक निश्चित जगह अद्वितीय प्रस्तुत करना। Stromal कोशिकाओं के अलावा, hematopoietic सेल प्रकार आलों में से कुछ के लिए कम से कम कुछ संकेतों प्रदान करके एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है। जाहिर है, आला संरचना की जटिलता बगल में उनके विश्लेषण की आवश्यकता है, और प्रतिरक्षण और hematologists अपने सेलुलर घटकों के बीच स्थानिक रिश्तों का विश्लेषण करके, जैसे अस्थि मज्जा माइक्रोआर्किटेक्चर, पर ज़ूम करने के लिए यह तेजी से महत्वपूर्ण बन गया है।
इधर, एक रणनीति प्रस्तुत किया है एक स्वचालित और निष्पक्ष तरीके से अस्थि मज्जा में सेलुलर सह स्थानीयकरण और पड़ोस रिश्तों यों की। फ्लोरोसेंट stromal कोशिकाओं और गैर फ्लोरोसेंट hematopoietic कोशिकाओं, undecalcified हड्डियों, पूरे हड्डी को कवर confocal छवियों के अधिग्रहण से ऊतकीय वर्गों की तैयारी है, साथ ही सेलुलर सी की स्वचालित छवि विश्लेषण, काइमेरिक चूहों की पीढ़ी सहित शरण एक विस्तृत कार्यप्रवाहओ-स्थानीयकरण और एक सिमुलेशन उपकरण के द्वारा यादृच्छिक स्थिति से उसका सत्यापन / भेदभाव (चित्रा 8) प्रदान की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आधुनिक ऑप्टिकल इमेजिंग के तरीकों में प्रगति के बावजूद, ऊतकीय डेटा का विश्लेषण अब भी अक्सर उचित मात्रा का ठहराव उपकरणों और तरीकों, के अभाव के कारण या ब्याज के एक छोटे से क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित है कि प?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम बहुमूल्य विचार विमर्श के लिए एंड्रियास Radbruch धन्यवाद। हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए जानवरों की देखभाल और रॉबर्ट गुंठर साथ सहायता के लिए Gruczek, पैट्रिक Thiemann और मैनुएला Ohde SABINE के लिए आभारी हैं। हम पांडुलिपि की proofreading के लिए ऊतक विज्ञान के नमूनों का मूल्यांकन और रैंडी Lindquist के लिए हमारे प्रशिक्षित रेटर लौरा Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, कैट्रीन रोथ, फ्लोरेंस Pache और कथरीना हॉर्न धन्यवाद। हम MBP के विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए जे और एन ली, मेयो क्लीनिक, Scottsdale, एरिज़ोना, संयुक्त राज्य अमरीका धन्यवाद।
इस काम के intravital माइक्रोस्कोपी के लिए जिमी-एक DFG कोर सुविधा नेटवर्क अनुदान द्वारा और द्वारा DFG HA5354 / 4-1, द्वारा समर्थित किया गया TRR130 / TP17, और DFG AEHSZ के लिए 2165 (HA5354 / 6-1) के लिए अंतर्राष्ट्रीय मैक्स प्लैंक द्वारा समर्थित किया गया संक्रामक रोगों और इम्यूनोलॉजी (IMPRS-ईदी), बर्लिन के लिए स्कूल।
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
Referências
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