조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
초점 현미경은 골수 같은 복잡한 조직 내에서 여러 종류의 세포 편재 분석위한 선택 방법이다. 많은 경우에 따라서 레이터 의존적 바이어스를 도입하고 자간 신뢰성을 감소의 위험을 담지 수동 계산에 의존하지만, 셀룰러 편재 및 정량 분석이 어렵다. 세포 유형은 그 발생 빈도의 차이가 특히 강하게 또한, 임의 위치로부터의 결과 두 셀 간의 공동 지역화 여부를 판단하는 것이 곤란하다. 여기서, 골수 세포 공동 편재 편견 정량 방법이 도입된다. 프로토콜은 골수를 포함한 전체 뮤린 긴 뼈의 조직 학적 섹션을 획득하기 위해 사용되는 샘플 제조뿐만 아니라, 염색 프로토콜과 고해상도 화상의 취득을 설명한다. 조혈 및 비 hemat의 인식에서 스패닝 분석 워크 플로우이들 셀 사이의 직접적인 접촉의 정량화 2 차원 (2D) 골수에서 이미지 opoietic 세포 유형이 제공된다. 이것은 또한 특정 세포 유형을 둘러싸 세포 미세 환경에 대한 정보를 얻기 위해, 이웃 분석을 포함한다. 두 종류의 세포 공동 지역화 랜덤 셀 위치의 단순한 결과 또는 셀 간의 우선 연결을 적용할지 여부를 평가하기 위해, 조혈뿐만 아니라 간질 세포의 경우,이 가설을 시험하기에 적합하다 시뮬레이션 도구이며, 사용. 이 방법은 골수에 한정되지 않으며, 조직 학적 데이터의 재현성, 정량 분석을 허용하기 위해 다른 조직으로 확장 될 수있다.
Introduction
인해 광학 현미경 이미지 등을 포함한 최근의 급속한 기술 발전에, 조직 전체의 문맥 내에서 세포의 분석은 면역학 점점 접근되고있다. 서스펜션에서 단일 세포의 특성은 세포 및 분자 기능을 이해하는 귀중한 불가결 방법을 나타냅니다. 그러나, 그들의 (마이크로) -anatomical 환경 내 세포의 분석은 면역 반응의 개발과 같은 복잡한 공정에서 공동 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 이해하는 데 필수적이다.
현미경 학자, 이미지의 정 성적 정보를 획득하는 것이 상대적으로 용이하지만, 그것은 부분적으로는이 분야의 분석 방법은 화상 획득 가능한 것과 비교 뒤쳐져 있다는 사실, 이들 데이터를 정량화 할 과제로 남아. 많은 연구자들은 여전히 시간 소모적 그들의 조직학 이미지에서 수동 세포 카운팅에 의존따라서 다른 평가자 사이에 바이어스를 도입하고 다른 그룹에 의해 복제를 방해. 때때로, 하나의 대표 이미지는 하드 독자가 이러한 경우의 통계적 관련성을 판단 할 만들기, 책에서 휴대 전화 위치 또는 공동 현지화에 문을 강조하기 위해 선택된다.
함께 화상 데이터의 전체 정보 콘텐츠가 거의 이용되지 않는다는 사실과, 이는 더 빠르고 편견 광범위한 조직 학적 방법이 이미지를 분석 할 필요성을 강조한다.
골수는 성인 척추 동물의 조혈 기관으로 중요한 기능 회복에 걸리는 복잡한 조직이다. 조혈 세포 1,2 출생지와 B 림프구의 발달 3 중요한 역할 외에, 또한 면역 반응 개시 4 성숙한 재순환 B 세포 5 지원되는 사이트로서 작용한다. 난을 유지하는 외에, 그 역할면역 메모리를 구성하는 세포의 여러 종류가 6-9이 존재하는 것으로 밝혀졌다으로 mmunological 메모리는 점점, 지난 10 년간 평가되고있다.
복잡한 조직 골수의 구조와 기능 사이의 관계는 여전히 애매 남아있다. 이러한 T 및 B 세포 영역으로 매크로 구획으로 구성되어 차 림프 기관과는 달리, 골수 맑은 매크로 구획화 없다. 지금까지 골수에서 별개의 구획 골 피질 또는 혈관의 근접에 의해 정의된다. 이러한지지 줄기 세포, B 세포 또는 장수 형질 세포 (PC와 같은 면역 기억 세포 집단 (유지), CD4 + 및 개발 등의 처리의 수에 대한 골수의 다양한 상주 간질 세포 집단의 중요성 CD8 + 메모리 T 세포)는 명확 골수 미세 구획화 어느 정도가 있음을 나타낸다.
<p클래스 = "jove_content은"> 이러한 관찰은 특정 기능 골수 (셀 유지 보수, 다양한 단계에서 B 세포 개발 및 면역 메모리의 유지 보수 줄기)를 전문으로하는 별개의 microanatomical 틈새 시장의 개념으로 이어졌다. 서로 다른 기능을 수행 틈새 사이에서 이질성의 어느 정도있을 것 같습니다 있지만, 이러한 CXC-케모카인 리간드 12 (CXCL12) 또는 인터루킨 7 (IL-7) 등의 기질 세포에 의해 생성되는 몇 가지 요소는 매우 중요 구성 요소 이러한 틈새 시장 (10)의 여러. 골수에서 시각화 및 간질 세포의 특성 때문에 가늘고 긴 돌기 확장 골수에 걸쳐 네트워크를 형성하는 자신의 형태 적 특징에 곤란하며, 해당 마커의 부족 기질 아 집단을 구별하기.이러한 틈새가 자신의 세포 및 분자 compositio에 대한 공통적 인 특징을 공유 어느 정도는 아직까지 명확하지 않다n 및 요소는 특정 틈새 시장 고유의 렌더링합니다. 간질 세포 이외에, 조혈 세포 유형은 틈새의 적어도 일부 특정 신호들을 제공함으로써 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 분명히, 틈새 조성물의 복잡성은 동일계에서의 분석이 필요하고, 면역학 및 혈액학는 세포 성분 사이의 공간적 관계를 분석하여, 예를 들어 골수 마이크로 아키텍처를 확대하는 것이 점점 더 중요 해지고있다.
여기에, 전략은 제시 자동화 및 편견 방법으로 골수 세포 공동 현지화 및 이웃 관계를 정량화한다. 형광 기질 세포 및 비 형광 조혈 세포, undecalcified 뼈, 전체 뼈를 덮는 공 초점 화상의 취득으로부터 조직 학적 단면의 제조뿐만 아니라, 셀룰러 (C)의 자동화 된 이미지 분석, 키메라 마우스의 생성을 포함하는 형질 상세한 플로오 – 현지화 및 시뮬레이션 툴에 의해 임의의 위치에서의 검증 / 차별 (그림 8)을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현대 광학 묘화 법의 진보에도 불구하고, 데이터의 조직 학적 분석은 여전히 종종 적절한 정량 도구와 방법의 부족 또는 관심사 작은 영역에 집중 편향된 분석에 의해 방해된다. 여기에 제시된 시너지 효과는 이미지 전체 골수 영역을 커버 분석, 자동 분할 및 다양한 조혈 및 간질 세포 유형, 공동 현지화 분석의 물체 인식, 새로운 관례가 제공하는 비 무작위로 발생하는 접점의 마지막 유효성…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 가치있는 토론 안드레아스 Radbruch 감사합니다. 우리는 우수한 기술 지원을 동물 관리 및 로버트 귄터에 대한 지원은 Gruczek, 패트릭 Thiemann와 마뉴 엘라 Ohde을 사빈에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 원고의 교정에 대한 조직 학적 샘플의 평가와 랜디 린드 퀴 스트에 대한 우리의 훈련 된 평가자 로라 Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, 카트린 로스, 피렌체 Pache와 카타리나 혼 감사합니다. 우리는 MBP-특이 항체에 대한 J. 및 N. 리, 메이요 클리닉, 스코 츠 데일, 애리조나, 미국 감사합니다.
이 작품은 생체 내에 현미경 지미-DFG의 핵심 시설 네트워크 연구비에 의해 DFG HA5354 / 4-1에 의해 지원되었다 TRR130 / TP17 및 DFG는 AEHSZ에 2165 (HA5354 / 6-1) 국제 막스 플랑크에 의해 지원되었다 감염증 및 면역학 (IMPRS-IDI), 베를린 (Berlin) 학교.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
Referências
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