Автоматизированная Количественное кроветворной клетки - Стромальные межклеточного взаимодействия в гистологических Изображения Undecalcified Bone
Summary
A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.
Abstract
Конфокальной микроскопии является методом выбора для анализа локализации нескольких типов клеток в пределах сложных тканей, таких как костный мозг. Тем не менее, анализ и количественная оценка клеточной локализации трудно, так как во многих случаях она опирается на ручном подсчете, тем самым принимая риск введения оценщик в зависимости от смещения и снижения надежности Interrater. Кроме того, часто бывает трудно судить о том, в совместной локализации двух клеток приводит из случайного позиционирования, особенно, когда типы клеток сильно различаются по частоте их появления. Здесь способ объективной количественной оценки клеточной совместной локализации в костном мозге вводится. Протокол описывает подготовку образца используется для получения гистологических срезов целых мышиных длинных костей в том числе костного мозга, а также протокол окрашивания и получение изображений высокого разрешения. Рабочий процесс анализа, охватывающих период от признания кроветворной и не-hematopoietic типы клеток в 2-мерных изображений мозга (2D) кости количественной оценки прямых контактов между этими клетками представлена. Это также включает в себя анализ окрестности, чтобы получить информацию о сотовой микросреды, окружающей определенный тип клеток. Для того, чтобы оценить, насколько совместная локализация двух типов клеток является лишь результатом случайного позиционирования клеток или отражает льготных ассоциации между клетками, инструмент моделирования, который предназначен для проверки этой гипотезы в случае гемопоэтических а также стромальных клеток, является используемый. Этот подход не ограничивается костного мозга, и может быть распространен на другие ткани, чтобы обеспечить воспроизводимое, количественный анализ гистологических данных.
Introduction
В связи с недавним быстрым развитием технологий в микроскопии, в том числе оптических изображений, анализ клеток в контексте всей ткани становится все более доступным для иммунологов. Характеристика отдельных клеток в суспензии представляет собой ценный и незаменимый метод, чтобы понять, клеточной и молекулярной функции. Тем не менее, анализ клеток в их (микро) -anatomical окружающей среды имеет важное значение для понимания взаимодействия между различными типами клеток, которые сотрудничают в сложных процессах, таких как развитие иммунных реакций.
Хотя это относительно легко микроскописты, чтобы получить качественную информацию из изображений, она остается проблемой для количественной оценки этих данных, отчасти из-за того, что методы анализа в этой области являются отсталыми по сравнению с тем, что можно в приобретении изображений. Многие исследователи до сих пор полагаются на трудоемкого ручного подсчета клеток в их гистологии изображений,Таким образом, введение смещения между разными оценщиками и препятствуя репликации другими группами. Часто один представитель изображение выбрано, чтобы подчеркнуть заявление на сотовый позиции или совместной локализации в публикации, что делает его трудным для чтения, чтобы судить статистической значимости такого события.
Вместе с тем, что подробную информацию содержание данных изображения редко эксплуатируют это подчеркивает необходимость более объективной, быстрее и комплексный подход к анализу гистологических изображений.
Костный мозг комплекс тканей, которые берет на себя важных жизненных функций как орган кроветворения у взрослых позвоночных животных. Помимо того, что родина для гемопоэтических клеток 1,2 и играет важную роль в развитии В-лимфоцитов 3, он также выступает в качестве места, где иммунные реакции инициируются 4 и поддерживает Зрелые, рециркуляции В-клеток 5. Кроме того, его роль в поддержании Immunological памяти становятся все более ценится в последнее десятилетие, поскольку некоторые типы клеток, составляющих иммунной памяти были найдены проживать там 6-9.
Соотношение между комплексной ткани архитектуры костного мозга и его функций все еще остается неясным. В отличие от вторичных лимфоидных органов, которые организованы в макро-купе, таких как Т и В-клеточных зонах, костного мозга не хватает четкого макро-раздробленности. До сих пор различные отсеки в костном мозге определяются их близости к кости коры или в сосудистой. Важность различных групп населения резидентов стромальных клеток в костном мозге в течение ряда процессов, таких, как поддержка стволовых клеток, развитие В-клеток или поддержания популяциях клеток иммунной памяти (например, долгоживущие плазменные клетки (ПК), CD4 + и CD8 + Т-клетки памяти) четко указывает на то, что существует определенная степень микро-компартментализацией в костном мозге.
<pкласс = "jove_content"> Эти наблюдения привели к концепции различных микроанатомической ниш, которые специализируются в определенных функциональных (STEM обслуживание клеток, развитие В-клеток на разных стадиях, и обслуживание иммунологической памяти) в костном мозге. Хотя там, кажется, определенная степень неоднородности среди ниш, которые выполняют разные функции, некоторые из факторов, произведенных стромальных клеток, таких как СХС-хемокинов лиганд 12 (CXCL12) или интерлейкина 7 (IL-7), являются важнейшими компонентами для некоторые из этих ниш 10. Визуализация и характеристика стромальных клеток в костном мозге затруднено из-за их морфологических особенностей с длинные, тонкие дендритные расширений формирования сети по всей костного мозга, а также отсутствие соответствующих маркеров для различения стромальных субпопуляций.Это еще не ясно, в какой степени эти ниши имеют общие черты с точки зрения их клеточной и молекулярной Compositioп, и какие элементы оказывают определенную нишу уникальным. В дополнение к стромальных клеток, гемопоэтических типы клеток, как было показано, чтобы играть решающую роль в обеспечении определенные сигналы по меньшей мере, для некоторых из ниши. Очевидно, что сложность ниши состава требуется их анализ на месте, и это становится все более важным для иммунологов и гематологи, чтобы увеличить микроархитектуры костного мозга, например, путем анализа пространственных отношений между ее клеточных компонентов.
Здесь стратегия для количественной сотовой совместной локализации и окрестности отношения в костном мозге в автоматическом и непредвзято представлена. Подробное рабочий в том числе генерации химерных мышей, несущие флуоресцентные стромальных клеток и не-люминесцентные кроветворных клеток, подготовки гистологических срезов от undecalcified костей, приобретение конфокальных изображений, охватывающих всю кость, а также автоматизированного анализа изображений с сотовойо-локализация и его проверка / с дискриминацией со случайной позиционирования с помощью инструмента моделирования обеспечивается (рисунок 8).
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на прогресс в современных оптических методов визуализации, анализа гистологических данных по-прежнему часто затруднено из-за отсутствия надлежащих инструментов количественного и методов, или предвзятых анализов, которые сосредоточены на небольшом участке. Синергетический…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Андреаса Радбрух за ценные обсуждения. Мы благодарны Сабине Gruczek, Патрик Thiemann и Мануэла Ohde за помощь по уходу за животными и Роберт Гюнтер для превосходного технической помощи. Мы благодарим наших квалифицированных рейтинговых агентств Лаура Эме, Jannike Байат-Sarmadi, Каролин Поллок, Катрин Рот, Флоренция паче и Катарина Рог для оценки образцов гистологии и Рэнди Линдквист для корректуры рукописи. Мы благодарим J. Н. Ли, Mayo Clinic, Скоттсдейл, Аризона, США для MBP-специфических антител.
Эта работа была поддержана DFG HA5354 / 4-1, Джими-базовую сеть DFG о предоставлении гранта для прижизненной микроскопии и TRR130 / TP17 и DFG ДЛЯ 2165 (HA5354 / 6-1) на AEHSZ при поддержке Международного Макса Планка Школа инфекционных болезней и иммунологии (IMPRS-IDI), Берлин.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neomycin | Sigma | N6386 SIGMA | Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate | |
| Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin) | Sigma | P4333 Sigma H3375 Sigma | www.sigmaaldrich.com |
| 4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin) | |||
| Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg | Rockland | D602-0100 | www.rockland-inc.com |
| 20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade) | Science Services | 15713 | EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | www.carlroth.com |
| Dry ice | |||
| Acetone | Sigma.Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com |
| Tissue-Tek cryomolds (standard) | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | www.sakuraus.com |
| Kawamoto's SCEM embedding medium | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryosection preparation kit | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Kawamoto's cryofilm type 2C(9) | Section-Lab, JP | http://section-lab.jp/index.html | |
| Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile | Thermo Scientific | 3052835 | L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01");www.thermoscientific.com |
| polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated | Rockland | 600-406-379 | www.rockland-inc.com |
| Alexa Fluor 555 streptavidin | Life Technologies | S-32355 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-MBP | J. and N. Lee | available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7 | |
| goat anti-rat-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | www.lifetechnologies.com |
| rat anti-B220 – Alexa Fluor 594 | produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies | ||
| mouse anti-l1 light chain -FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136 | ||
| rat anti-k light chain – FITC | produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1 | ||
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma | D9542 SIGMA | www.sigmaaldrich.com |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | www.dako.com |
| Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm) | Carl Roth | H875.2 | www.carlroth.com |
| Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm) | VWR | 48311-703 | www.vwr.com |
| Laser scanning confocal microscope | equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software. | ||
| Automated image analysis tools for bone marrow | Wimasis, Munich | The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de | |
| VC2012 Runtime | Microsoft | free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679 | |
| Simulation tool for random cell positioning | available from us, upon request | ||
| Image analysis software with image segmentation functions | We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org) | ||
| Fiji image analysis software | free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3). |
Referências
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2014).
- Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development. Immunity. 20, 707-718 (2004).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Sapoznikov, A., et al. Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches. Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).
- Tokoyoda, K., et al. Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow. Immunity. 30, 721-730 (2009).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Lin, G. H., et al. Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow. Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).
- Zehentmeier, S., et al. Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells. Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).
- Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in ‘knock-in’ Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies. Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).
- Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells. Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).
- Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).
- Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot’s film method. Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).
- Smith, C. L., et al. Basic confocal microscopy. Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley … [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).
- Hughes, I., Hase, T. . Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).
- Quinn, G. P., Keough, M. J. . Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).
- Kiel, M. J., Morrison, S. J. Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells. Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).
- MacQueen, J. B. Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations. Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Jarjour, M., et al. Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells. J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37, 364-376 (2012).
- Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37, 351-363 (2012).
- Siffrin, V., et al. In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis. Immunity. 33, 424-436 (2010).
- Shen, Q., et al. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
- Danielsson, P. E. Euclidian distance mapping. Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).
- Tellier, J., Kallies, A. Finding a home for plasma cells – a niche to survive. Eur J Immunol. , (2014).
- Winter, O., et al. Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow. Blood. 116, 1867-1875 (2010).
- Rozanski, C. H., et al. Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells. J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).
- Rodriguez Gomez, M., et al. Basophils support the survival of plasma cells in mice. J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).
- Belnoue, E., et al. Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche. J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).
- Kohler, A., et al. G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands. Blood. 117, 4349-4357 (2011).
