A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.
Små molekyler giver rige mål for biosensorer applikationer på grund af deres fysiologiske implikationer som biomarkører for forskellige aspekter af menneskets sundhed og ydeevne. Nukleinsyre-aptamerer er blevet mere og mere anvendt som anerkendelse elementer på biosensor platforme, men at vælge aptamere mod små molekyler mål kræver specielle design overvejelser. Dette arbejde beskriver modifikation og kritiske trin i en fremgangsmåde designet til at vælge struktur-switching aptamerer til lavmolekylære mål. Bindingssekvenser fra et DNA-bibliotek er hybridiseret til komplementære DNA indfangningsprober på magnetiske perler separeres fra nonbinders via en target-induceret ændring i konformation. Denne fremgangsmåde er fordelagtig, fordi sekvenser bindende bærermatrixen (perler) ikke vil blive yderligere forstærket, og det ikke kræver immobilisering af målmolekylet. Imidlertid er smeltetemperaturen af indfangningsproben og bibliotek holdt ved eller lidt over stuetemperatur, således at sekvenser that dehybridize baseret på termodynamik vil også være til stede i supernatanten. Dette begrænser effektivt effektivitet opdeling (evnen til at adskille målbindingssekvenserne fra nonbinders), og derfor er mange udvælgelsesrunder vil være forpligtet til at fjerne baggrunden sekvenser. Den rapporterede metode adskiller sig fra tidligere struktur-skift aptamer markeringer forbindelse med gennemførelse af negative udvælgelse trin, forenklet berigelse overvågning og udvidelse af længden af indfangningsproben efter valg berigelse at give øget stringens. De udvalgte struktur-switching aptamerer er fordelagtige i en guld nanopartikel assay platform, der rapporterer tilstedeværelsen af et target molekyle ved den konformationelle ændring af aptamer. Guldet nanopartikel assay blev anvendt, fordi det giver en enkel, hurtig kolorimetrisk udlæsning der er gavnligt i et klinisk eller indsat miljø. Design og optimering overvejelser præsenteres for analysen som proof-of-principle arbejde i buffer til at danne grundlag for yderligere forlængelse af arbejdet hen imod småmolekyle biosensorer i fysiologiske væsker.
Små molekyler har længe været anerkendt som spiller afgørende roller i forskellige biologiske processer såsom fysiologisk toksicitet eller ernæring, cellesignalering, og som farmaceutiske behandlinger for sygdom 1. Forskellige små molekyler er også blevet foreslået som biomarkører vejledende fysiologiske betingelser, herunder stress 2,3, træthed 4, og sygdom 5. For eksempel forhøjede cortisol niveauer korrelerer med stress, som kan resultere i nedsat fysiologisk ydeevne og andre sundhedsmæssige forhold 6-8. Ligeledes variationer i forholdet mellem visse peptider i spyt er prædiktive for træthed, hvor fysiologiske manifestationer omfatter manglende koncentration, nedsat reaktionstid og nedsat kognitiv funktion 4. Derfor kan udviklingen af target-specifikke biosensorer til at overvåge niveauerne af små molekyler giver en uvurderlig parameter til vurdering af de sundhedsmæssige og ydeevne kapaciteter af en indivelle.
Historisk har lille molekyle påvisning udført ved arbejdsintensive separationsteknikker eller antistof baseret genkendelse 6,7. Mere for nylig er nukleinsyresekvenser aptamerer 9,10 opstået som genkendelseselementer der besidder tydelige fordele i forhold til antistoffer i specifikke applikationer. Med deres evne til at binde et mål varierer i størrelse fra metalioner 11 til væv 12, er aptamere været almindeligt anvendt som anerkendelse elementer i biosensorer platforme 13,14. Sammenlignet med antistoffer, er aptamerer kemisk syntetiseret, og det er derfor nemt at indføre reproducerbare kemiske modifikationer til overfladen immobilisering eller rapportering. Aptamerer kan vælges med høj målspecificitet under de ønskede betingelser ved at ændre udvælgelsen anvendte betingelser, hvorimod antistoffer er begrænset til fysiologiske betingelser 15,16. Desuden aptamerer er i stand til højere liganddensitet grund thEIR mindre størrelse, hvilket resulterer i højere mål signalerer effektivitet på en biosensor platform, og den forbedrede stabilitet aptamere tillader gentagen brug og langsigtet sensor opbevaring 16.
Aptamerer er genereret ved hjælp af en procedure kendt som SELEX, hvor en første bibliotek af sekvenser udviklet sig fra 10 13 -10 15 unikke molekyler til et beriget endelige pool indeholder flere (10 1 -10 2) sekvenser med potentiale til at binde målmolekylet. Den endelige beriget pool derefter sekventeret, og dissociationskonstanter (K D) opnået fra bindingsassays af højeste kopiantal sekvenser med målmolekylet. Udviklingen af puljen til en endelig beriget population spores ved overvågning af procentdel af puljen bindende mål i hver runde, indtil maksimal berigelse er opnået. Dette sker over flere evolutionære runder, hvor bindende sekvenser er partitioneret fra nonbinders og AMPLceret ved hjælp af polymerasekædereaktion (PCR). Evnen til effektivt at partitionere og fastholde bindemidler er en af de vigtigste bestemmende faktorer for effektiviteten af udvælgelse og direkte påvirker egenskaberne ved de udvalgte aptamererne 15. Opdeling fase SELEX er mere udfordrende for små molekyler, da de ikke har den størrelse eller forskellige funktionelle grupper, som hjælper opdelingen processen proteinmål 1,15. For eksempel har mange protein partitionering platforme afhængige størrelse eller ladning baseret separation, men egenskaberne af bundne DNA-small molecule mål-komplekser er generelt ikke væsentligt anderledes end ikke-bindende sekvenser, hvilket resulterer i ineffektiv opdeling 1. Alternative SELEX partitionering metoder kan involvere immobilisering eller mærkning af målet, som potentielt ændre de bindende egenskaber ved et lille molekyle. Derfor til design af en udvælgelsesprocedure generere aptamere for lille molekyle mål for Fequires særlige hensyn.
En række ændringer er blevet anvendt til den oprindelige SELEX henblik på at øge effektiviteten af opdelingen af proceduren, forbedre affinitet eller specificitet af sekvenserne i den endelige pulje, eller gøre det mere modtagelig for forskellige applikationer 15,16. En SELEX modifikation stand til at udvælge for små molekyler blev designet til at generere struktur-switching aptamerer eller aptamerer, som undergår en konformationel ændring ved at interagere med målmolekylet 17,18. I et eksempel på denne fremgangsmåde biblioteket hybridiserede til et kort stykke ikke-bindende komplementært DNA (cDNA) immobiliseret på magnetiske perler 17. Ved target binding konformationsændringen bindende sekvenser gør det muligt at dehybridize fra cDNA, frigive dem i supernatanten, mens nonbinders forbliver hybridiseret til cDNA / perler magnetisk delt og kasseres. Denne metode er Advanessant for små molekyler, fordi det ikke kræver immobilisering eller mærkning af målmolekylet for at opnå separation.
Aptamerer der er i stand til struktur-switching besidder en værdifuld funktion for enhver potentiel biosensor platform, der kræver en ændring i aptamer struktur til at detektere tilstedeværelsen af et target-molekyle. Specifikt kan aptamerer kombineres med guld nanopartikler (AuNPs) for at skabe assays, der fungerer på grundlag af struktur-switching princip at frembringe en kolorimetrisk reaktion i nærvær af målmolekylet efter salt udfordring 19,20. I et AUNP assay enkeltstrenget DNA (ssDNA) aptamer oprindeligt adsorberer til AUNP overflade og beskytter den mod salt udfordring. Tilstedeværelsen af målet inducerer en konformationel ændring i aptamer, der udsætter AUNP overflade, hvilket resulterer i en rød-til-blå farveændring efter salttilsætning. AUNP assays har også vist sig at forstærke signalet, hvor mikromolær affinitet aptamers kan detektere mål på niveauer størrelsesordener lavere end dissociationskonstanten (Kd) 21. Denne funktion er især attraktivt for små molekyler mål, hvor tilhørsforhold typisk fra lav mikromolære til millimolære koncentrationer 1,15. Generelt er assayet også hurtig og relativt enkel at udføre, fremme yderligere undersøgelse af aptamer-AUNP assays som biosensor detektion platforme.
Målet med dette arbejde er at give en universel protokol til valg struktur-skifte aptamere til små molekyler til biosensorer applikationer ved hjælp af stress markør cortisol som repræsentant molekyle. En ordning AUNP biosensor afsløring er af interesse på grund af sin enkelhed drift og kolorimetrisk udlæsning, men struktur-skift aptamere gælder for alternative sensing platform udgange, såsom elektrokemisk 22 eller fluorescens 23, der også kan registrere via en ændring i aptamer conformation ved target binding. Sammenlignet med tidligere fremgangsmåder, var flere negative selektionssystemer trin indarbejdet i designet 17,18, og en simpel UV-baserede ordning berigelse påvisning blev gennemført (figur 1). Denne protokol er i modsætning til radioliganden berigelse afsløring ordning, der anvendes i ældre metoder 17. Den foreslåede metode også indarbejdet en stigning i længden af cDNA opfangningsprober anvendt i udvælgelsen for at øge effektiviteten opdeling og effektivt tune stringensen af udvælgelsen efter maksimal berigelse blev observeret 24. Den tunet stringens føre til et lavere samlet procentdel af DNA elueres ved målet i den sidste pulje, men resulterede i højere antal af en sekvens kopi, der er bundet med øget affinitet i forhold til det højeste kopiantal sekvens fra en tidligere runde. Den højeste kopiantal sekvens fra den endelige pulje blev påsat en AUNP assay for at illustrere, at sekvensen var modtagelig for en platformder kræver en strukturændring for at angive mål bindende. Denne buffer baseret assay viser, at reaktionen fra AUNP analysen kan ændres ved at ændre tætheden af DNA påføres overfladen, og tjener som proof-of-principle arbejde at afsætte den fremtidige forskningsindsats mod at udvikle små molekyler aptamer-baserede AUNP biosensorer i fysiologiske væsker.
Det faktum, at små molekyler er af biologisk interesse, men kun udgør 19% af alle aptamere indberettede gør, som sigter til udvælgelse aptamerer, der gælder for små molekyler af stor betydning. SELEX af små molekyler er særligt udfordrende som færre funktionelle grupper, strukturelle motiver og areal er til rådighed for interaktion med sekvenser i forhold til proteiner 1, og det er blevet anslået, at mindre end 30% af markeringer for alle mål forsøgte har resulteret i en aptamer 38. Derfor skal man være exceptionelt klar over eksperimentelle design og udførelse for at kunne vælge en aptamer til et lille molekyle target.
Aptameren udvælgelsesmetode er beskrevet i dette arbejde er fordelagtig, fordi den er anvendelig til små molekyler uden at kræve nogen kemisk modifikation, der kan ændre deres bindende egenskaber. Det er også eluering baseret, hvilket betyder, at eftersom than DNA, snarere end målet, indledningsvis bundet derefter elueret fra de magnetiske perler ved målet, DNA interagere med perlen matrix vil ikke blive amplificeret for næste udvælgelsesrunde, fordi bindemidler til molekylet af interesse frigives i supernatanten buffer og ikke-specifikke matrix bindemidler forbliver bundet. Omvendt er en negativt udvælgelsesmetode mod matricen for metoder, der immobilisere målet på den faste bærer hver runde, fordi DNA, der interagerer med matrixen vil blive forstærket i tillæg til de målrettede bindemidler 1. Den nuværende fremgangsmåde er udformet som et T m begrænset udvalg strategi. Dette betyder, at T m af cDNA / pool hybridisering blev holdt tæt på stuetemperatur. Morse anvendes en lignende strategi, men anvendte en 6-mer-cDNA-probe med en T m <10 ° C med udvælgelse betingelser ved 4 ° C 17. Vores ansøgning var for en biosensorer assay udføres ved stuetemperatur, så længden af cDNA blev justeret ifølgely. Dette holder stringens af markeringen så lav, at potentielle bindemidler ikke går tabt, fordi målet bindingsinteraktionen forekommer i et fjerntliggende sted, der ikke inducerer en konformationsændring stand til at afbryde cDNA binding. Men effektivitet opdelingen af den foreslåede metode er lav, fordi nogle sekvenser vil dehybridize alene baseret på termodynamik. I modsætning hertil Nutiu et al. Anvendt en 15-mer-cDNA, og var kun i stand til at identificere aptamere for to af de fire mål, muligvis fordi Tm af de 15-mer var for høj til at tillade en frigivelse af en lille molekyle mål 18.. Derfor, mens den aktuelle markering strategi vil kræve mange runder for at fjerne baggrunden sekvenser, ved at styre stringens udvælgelse og minimere tab af potentielle bindere sandsynligheden for succes vil blive øget.
Mange forskere nye til aptamer udvælgelse er uvidende om vigtige aspekter i forbindelse med PCR afpotentielle bindemidler. Cycle optimering (afsnit 4.5) er nødvendig, fordi over-forstærkning af DNA-biblioteker producerer uønskede biprodukter (typisk større i størrelse) ved høje tal cyklus, og det ønskede produkt kan helt forsvinde med et overskud på kun 5 cyklusser 39. I tilfælde af over-amplifikation PCR-produkterne ikke længere udgør de sekvenser elueret ved målet, og chancerne for udvælgelse succes er betydeligt formindsket. Figur 4 illustrerer et eksempel på cyklus optimering fra runde 5 i dette arbejde. Den laveste cyklus producerer en minimal produkt band, bandet stigninger i mængden gennem 8 cykler; ved 10 cykler bandet begynder en overgang til en højere størrelse over-forstærkning produkt, og er næsten udelukkende består af over-amplificerede produkt inden for 12 cyklusser. En anden detalje, som mange forskere uerfarne i SELEX kan overse er, at hele puljen skal forstærkes i stor skala PCR-amplifikation (afsnit 4.6) i granst rundt for at afbøde tabet af bindemidler. Antallet af unikke sekvenser muligt fra oligonucleotider er 4 N, hvor 4 repræsenterer de fire nukleinsyrebaser, og N er antallet af baser i tilfældig region af biblioteket. For dette arbejde, N = 40, hvilket resulterer i en sekvenser rum på 1,2 x 10 24 mulige unikke sekvenser. 2,5 nmol bibliotek anvendt i den første runde af selektion svarer til ~ 10 15 molekyler, hvilket betyder, at hver kopi af DNA sandsynligvis er repræsenteret i den oprindelige pulje som en unik sekvens. Derfor skal hele mængden af DNA elueres fra perlerne ved målet forstærkes at beholde en kopi af hver enkelt potentiel bindemiddel til næste runde i udvælgelsen. Når denne indledende forstærkning har fundet sted, kan vælges i følgende runder, hvor der er antaget med prøveudtagning en homogen opløsning flere kopier.
Koncentrationen af mål, bør også overvejes nøje i hver runde. Nutiu et al. Brugda koncentration på 1 mM mål gennem hele udvælgelsesprocessen, og valgt en ATP aptamer med K d = 600 pM 18. Både den nuværende arbejde og forskning i Morse 17 begyndte med 100 uM mål, faldende gennem hele markeringen, og resulterede i aptamere med lave mikromolære tilhørsforhold. Præcis hvilke runde stringens bør øges (lavere koncentration mål) afhænger af, hvornår berigelse overholdes. Et andet afgørende skridt er at anvende passende negative selektionssystemer trin, så aptamerer påvise specificitet til målmolekylet. Som anvendes kontroller er betinget af den tilsigtede anvendelse af den valgte aptameren. For eksempel blev aptamer 15-1 designet til at fungere som en anerkendelse element i en biosensorer assay for cortisol, så progesteron blev anvendt som en negativ udvælgelse molekyle, fordi det er en metabolisk precursor for cortisol, der findes i fysiologiske væsker 40. ATP aptamer udvalgt af Nutiu et al. </ Em> ikke omfatter et negativ udvælgelse skridt, og interagerer med lignende struktur molekyler, herunder ADP, AMP, adenosin, og dATP 18.
En sidste bemærkning til overvejelse er, at AUNP analysen ofte kræver en betydelig optimering for hver aptamer / målpar. Leder du efter den mængde salt, der inducerer en knap visuelt mærkbar forandring i retning af en blå nuance efter salttilsætning er et godt udgangspunkt, men justering af udgangspunktet kan være forpligtet til at overholde et svar. Vi har også fundet, at assayet producerer drastisk forskellige reaktioner afhængig af koncentrationen buffer (udvælgelse buffer kan kræve fortynding fordi den høje saltkoncentration af buffere ofte forårsager aggregering) og sammensætning, grad af DNA dækning (figur 3), prøveforberedelse (nogle organiske opløsningsmidler anvendes til at opløse målet kan forårsage en høj baggrund, som maskerer målrette respons), temperatur, salt type og koncentration og INCUBAtion tid (både DNA med AUNP og DNA / AUNP med mål). Under fuldt optimerede betingelser, er resultaterne typisk observeres med et mål inkubationstid <5 min, hvilket viser fordelen ved en hurtig mål reaktion på AUNP biosensorer platform. For eksempel i figur 5 inkubationstiden for aptamer / AUNP trin blev reduceret fra O / N (figur 3) til 30 min, og salt blev tilsat øjeblikkeligt (<10 sek) efter mål tilsætning snarere end 20 min senere (figur 3 ) ved en belastning densitet på 73 D / NP. Dette øgede cortisol reaktion på ~ 82% højere end den tomme (figur 5A) ved en koncentration 10 pM mål versus ~ 40% ved anvendelse af de tidligere betingelser (figur 3). Denne reaktion kan skelnes med det blotte øje (figur 5B). Bemærk, at det lineære område af cortisol detektion er anderledes end ved hjælp af de tidligere betingelser, hvilket tyder på, at disse betingelser kan optimeres til en ønsketdetekteringsområde. Cholsyre og 2-methoxynaphthalen (2MNP) kontrol førte ikke til en signifikant respons (figur 5A-B). Forskerne skal være klar over at reducere disse inkuberingstider kan fremme øget respons af analytter med AUNP overflade, som kan bidrage til den samlede forbedrede signal (mål) eller baggrund (uden for målgruppen molekyler). Derfor er det nødvendigt forsigtig AUNP assay design og ydeevne karakterisering for hver aptamer / målpar.
Denne procedure beskriver en protokol til valg af små molekyler struktur-switching aptamerer, der fungerer i en biosensorer platform som beskrevet AUNP assay, som kræver en konformationsændring af DNA til at påvise tilstedeværelsen af målet. Imidlertid kunne denne metode anvendes på andre biosensor systemer såsom elektrokemisk eller fluorescens, der fungerer på samme præmis for stort set alle mål størrelse. Den effekt af protokol kan videreudvikles eksperimentelt vedflere tilgange. For det første kan udvælgelsen selv potentielt forbedres ved at undersøge metoder til optimering såsom fastlæggelsen ideelle Tm af cDNA / library hybridisering, der giver en interaktion, der er svag nok til at interagere med et lille molekyle mål, men stærk nok til at reducere mængden af baggrunden sekvenser udelukkende dehybridized fra termodynamik. Dette vil kondensere antallet af cykler, der er nødvendige for udvælgelse, hvilket sparer tid i arbejdskraft og reducerende reagens forbrug. Yderligere undersøgelser modifikationer til udvælgelse ville være at bestemme de mest fordelagtige koncentrationer af perler og DNA, således at en forskelligartet population af sekvenser er eksponeret til målet, især i den indledende runde. Succesen af disse proof-of-principle eksperimenter giver et fundament til at investere yderligere midler til at optimere og tilpasse AUNP buffer analysen til fysiologiske væsker. Der er et legitimt behov for en hurtig, robust biosensorer platform, der kan function som et diagnostisk redskab af den fysiologiske tilstand af en individuel, og yderligere udvikling af AUNP assay i humant serum, ville sved eller spyt opfylde en denne aktuelle hul.
The authors have nothing to disclose.
This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dynabeads M280 Streptavidin | Invitrogen | 112.06D | Compatible with DynaMag-2 Magnet |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin |
Streptavidin Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5113-01 | This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | ≥98% |
Progesterone | Sigma | P0130 | ≥99% |
Cholic Acid | Sigma | C1129 | ≥98% |
NanoDrop ND-1000 | NanoDrop | ND-1000 | Replaced by ND-2000 model |
Tris Base | Promega | H5135 | ≥99.9% |
Sodium Chloride | Sigma | S9888 | ≥99.5% |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% |
500 mL Filter System | Corning | 430769 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
DNA Library | Operon | Custom | HPLC purified |
All other DNA | IDT | Custom | Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC |
Thermomixer | Eppendorf | R | Any model with temperature and mixing speed control will work |
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn | Agilent | 600674 | Taq polymerase can be used as well |
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade | Agilent | 200415 | Other brands will work here |
10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer | Agilent | 200532 | This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase |
GeneAmp PCR System | Applied Biosystems | 9700 | Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work |
Agarose-LE | Ambion | AM9040 | ≥99.9% |
Ethidium Bromide | Sigma | E-1510 | Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen |
Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style | Glen Research | 20-0021-01 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe |
Replacement Filters Expedite | Glen Research | 20-0021-0F | 1 µm size |
Illustra NAP-25 Columns | GE Healthcare | 17-0852-01 | Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | ThermoFisher Scientific | 66205 | 2k MWCO used |
Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important |
Sodium Citrate Dihydrate | SAFC | W302600 | We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays |
SpectraMax | Molecular Devices | M5 | Results were similar to Bio-TEK system |
Synergy | Bio-TEK | HT | Results were similar to Molecular Devices system |
HEPES Buffer | Amresco | J848 | Any brand that makes a sterilized product will work |
250 mL Filter System | Corning | 430767 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Other brands will work here |
5 mL Syringe | Becton-Dickinson | 309646 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column |
ThermoEC Minicell Primo | ThermoFisher Scientific | EC320 | Compatible with Power Supply |
Power Supply | Fisher Scientific | FB300 | Compatible with ThermoEC Minicell Primo |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | Flammable liquid |
2 Methoxynaphthalene | Sigma | 148245 | 99% |
Assay Plate | Corning | 3370 | 96-well Flat Bottom, Sterile |