A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.
Små molekyler gi rike mål for biosensing programmer på grunn av deres fysiologiske implikasjoner som biomarkører for ulike aspekter av menneskers helse og ytelse. Nukleinsyre aptamerer har blitt stadig mer brukt som gjenkjennelseselementer på biosensor plattformer, men velge aptamerer mot små molekyl mål krever spesielle design hensyn. Dette arbeidet beskriver modifikasjon og kritiske trinn i en metode utviklet for å velge struktur bytte aptamerer til små molekyl mål. Bindings sekvenser fra en DNA-bibliotek hybridisert til komplementær DNA oppfangingsprober på magnetiske kuler er adskilt fra nonbinders via en target-indusert endring i konformasjon. Denne fremgangsmåte er fordelaktig fordi sekvenser bindende bærermassen (perler) ikke vil bli ytterligere forsterket, og den ikke krever immobilisering av målmolekylet. Imidlertid er smeltetemperaturen for fangst probe og biblioteket ble holdt ved eller litt over romtemperatur, slik at sekvensene tlue dehybridize basert på termodynamikk, vil også være til stede i den overliggende oppløsning. Dette begrenser effektivt partisjone effektivitet (evne til eget mål bindende sekvenser fra nonbinders), og derfor mange valgrunder vil bli pålagt å fjerne bakgrunns sekvenser. Den rapporterte metoden skiller seg fra tidligere struktur bytte aptamer valg på grunn av implementering av negative seleksjons trinn, forenklet berikelse overvåking, og utvidelse av lengden på fangst sonde følgende utvalg berikelse å gi økt stringens. De valgte struktur veksling aptamerer er fordelaktig i en gull nanopartikkel assay plattform som rapporterer tilstedeværelse av et målmolekyl ved konformasjonsendring av aptamer. Gullet nanopartikkel assay ble anvendt fordi den er en enkel, rask kolorimetrisk avlesning som er fordelaktig i en klinisk eller distribuert miljø. Design og optimalisering hensyn presenteres for analysen som proof-of-principle arbeid i buffer for å gi et grunnlag for videre forlengelse av arbeidet mot lite molekyl biosensing i fysiologiske væsker.
Små molekyler har lenge vært anerkjent som å spille viktige roller i ulike biologiske prosesser som fysiologisk toksisitet eller ernæring, cellesignalering, og som farmasøytiske behandlinger til sykdom 1. En rekke små molekyler er også blitt foreslått som biomarkører indikative av fysiologiske tilstander som stress 2,3, tretthet 4 og 5 sykdom. For eksempel, forhøyede kortisolnivåer korrelerer med stress som kan føre til redusert fysiologisk ytelse og andre helsemessige forhold 6-8. Likeledes, variasjoner i prosenter av visse peptider i spytt er prediktiv av trøtthet, der fysiologiske manifestasjoner inkluderer mangel på konsentrasjon, nedsatt reaksjonstid og redusert kognitiv funksjon 4. Derfor kan utviklingen av målspesifikke biosensorer for å overvåke nivåene av små molekyler gir en uvurderlig målet for å vurdere de helsemessige og yteevnen til en individual.
Historisk har lite molekyl deteksjon blitt utført av arbeidsintensive separasjonsteknikker eller ved antistoff basert anerkjennelse 6,7. Mer nylig har nukleinsyre aptamerer 9,10 dukket opp som gjenkjenningselementer som besitter distinkte fordeler i forhold til antistoffer i spesielle anvendelser. Med sin evne til å binde et mål varierende i størrelse fra metallioner 11 til vev 12, har aptamerer blitt mye brukt som gjenkjennelseselementer i biosensing plattformer 13,14. Sammenlignet med antistoffer, er aptamerer kjemisk syntetisert, og det er derfor enkelt å innføre reproduserbare kjemiske modifikasjoner for overflate immobilisering eller rapportering. Aptamerer kan velges med høy target spesifisitet under de ønskede forholdene ved å endre valg betingelser som benyttes, mens antistoffer er begrenset til fysiologiske forhold 15,16. I tillegg, aptamerer er i stand til større tetthet på grunn av ligand til thEir mindre størrelse, noe som resulterer i høyere target signaleringseffektivitet på en biosensor-plattform, og den forbedrede stabilitet av aptamerer tillater gjentatt bruk og langtidslagring 16. sensor.
Aptamerer er generert ved hjelp av en fremgangsmåte kjent som SELEX, karakterisert ved at en første bibliotek av sekvenser som er utviklet seg fra 10 13 -10 15 unike molekyler til en anriket slutt basseng som inneholder flere (10 1 -10 2) sekvenser med potensialet for å binde målmolekylet. Den endelige anriket bassenget blir deretter sekvensert, og dissosiasjonskonstantene (K d) oppnås fra bindingsanalyser av de høyeste kopitallsekvenser med målmolekylet. Evolusjon av bassenget til en endelig beriket befolkning spores ved å overvåke andelen bassenget bindende målet i hver runde, inntil maksimal berikelse oppnås. Dette skjer over en rekke evolusjonære runder, hvor bindende sekvenser er partisjonert fra nonbinders og amplsert ved hjelp av polymerase kjedereaksjon (PCR). Evnen til å effektivt partisjonere og beholde bindemidler er en av de viktigste faktorer som bestemmer effektiviteten av valg og direkte påvirker egenskapene til de valgte aptamerer 15. Den SELEX partisjone scenen er mer utfordrende for små molekyler, siden de ikke har den størrelsen eller rekke funksjonelle grupper som hjelper partisjoneringsprosessen protein mål 1,15. For eksempel er mange proteiner partisjone plattformer avhengige størrelse eller ladning basert separasjon, men egenskapene av bundet DNA-småmolekylære target-komplekser er generelt ikke signifikant forskjellig enn for ikke-bindende sekvenser, noe som resulterer i ineffektiv partisjone 1. Alternative SELEX partisjone metoder kan involvere immobilisering eller etikettering av målet, som potensielt kan endre de bindende egenskapene til et lite molekyl. Følgelig til utforming av en utvelgelsesprosedyre generere aptamerer for lite molekyl rettet requires spesielle hensyn.
En rekke modifikasjoner er blitt påført på den opprinnelige SELEX metode for å forbedre effektiviteten oppdeling av prosedyren, forbedre affiniteten og spesifisiteten av sekvensene i den endelige basseng, eller gjøre den mer mottagelig for forskjellige applikasjoner 15,16. En SELEX modifikasjon i stand til å velge for små molekyler er designet for å generere struktur-bytte aptamerer eller aptamerer som gjennomgår en konformasjonsendring på samspill med målmolekyl 17,18. I ett eksempel på denne fremgangsmåten, blir biblioteket hybridisert til et kort stykke av ikke-bindende komplementært DNA (cDNA) immobilisert på magnetiske kuler 17. Ved target binding, muliggjør konformasjonsendring bindingssekvenser dem til dehybridize fra cDNA og frigjør dem inn i det overliggende oppløsning, mens de resterende nonbinders hybridiserte til cDNA / perlene er magnetisk skilt og kastet. Denne metoden er fortrinnaktig for små molekyler, fordi det ikke krever immobilisering eller merking av målmolekylet for å oppnå separasjon.
Aptamerer som er i stand til struktur-svitsjing ha en verdifull egenskap for enhver potensiell biosensor plattform som krever en endring i aptamer struktur for å påvise tilstedeværelse av et målmolekyl. Nærmere bestemt, kan aptamerer kombineres med gull nanopartikler (AuNPs) for å skape assays som funksjon basert på struktur-bytter prinsippet å produsere en kolorimetrisk respons i nærvær av målmolekyl etter salt utfordring 19,20. I en AuNP analysen, den enkelttrådet DNA (ssDNA) aptamer utgangspunktet adsorberes til AuNP overflaten og beskytter det mot salt utfordring. Tilstedeværelse av target induserer en konformasjonsendring i aptamer som eksponerer AuNP overflaten, noe som resulterer i en rød-til-blå fargeskift etter salttilsetningen. AuNP analyser har også vist seg å forsterke signalet, hvor mikromolar affinitet aptamers kan oppdage mål på nivåer størrelsesordener lavere enn dissosiasjonskonstanten (K d) 21. Denne funksjonen er spesielt attraktivt for små molekyl mål, hvor slektskap vanligvis spenner fra lav mikromolar til millimolare konsentrasjoner 1,15. Vanligvis er analyse også rask og relativt enkel å utføre, og oppmuntrer videre studier av aptamer-AuNP assays som biosensor deteksjons plattformer.
Målet med dette arbeidet er å gi en universalprotokoll for valg av struktur-bytte aptamerer til små molekyler for biosensing applikasjoner ved hjelp av stress markør kortisol som en representant molekyl. En AuNP biosensor deteksjon ordningen er av interesse på grunn av sin enkelhet av drift og kolo avlesning, men struktur bytte aptamerer gjelder for alternative sensing plattform utganger, for eksempel elektro 22 eller fluorescens 23 som også sørger for gjenkjenning via en endring i aptamer conformation på målet bindende. Sammenlignet med tidligere metoder, ble flere negative seleksjons skritt innlemmet i design 17,18, og en enkel UV-basert berikelse deteksjon ordningen ble innført (figur 1). Denne protokollen er i kontrast med radioligand berikelse deteksjon ordningen brukes i eldre metoder 17. Den foreslåtte fremgangsmåte også innlemmet en økning i lengden av cDNA oppfangingsprober som brukes i valget for å øke effektiviteten partisjonering og effektivt tune stringensen av markeringen etter maksimal anrikning ble observert 24. Den avstemte stringens føre til en lavere total prosentandel av DNA elueres ved målet i den endelige bassenget, men resulterte i høyere kopiantall av en sekvens som er bundet med forbedret affinitet i forhold til den høyeste kopitall-sekvens fra en tidligere runde. Den høyeste kopitall-sekvens fra det endelige bassenget ble påført på en AuNP assay for å illustrere at sekvensen var mottagelig for en plattformsom krever en strukturell endring for å indikere mål bindende. Denne bufferen baserte analysen viser at responsen fra AuNP analysen kan modifiseres ved å endre densiteten av DNA påført på overflaten, og tjener som bevis-for-prinsipp arbeid å vie fremtidige forskningsinnsats mot å utvikle lite molekyl aptamer-baserte AuNP biosensorer i fysiologiske væsker.
Det faktum at små molekyler som er av biologisk interesse, men utgjør bare 19% av alle aptamerer rapportert gjengir fremgangsmåter utformet for å velge aptamerer som er anvendelig på små molekyler av stor betydning. SELEX av små molekyler er spesielt utfordrende som færre funksjonelle grupper, strukturelle motiver, og arealet er tilgjengelige for interaksjon med sekvenser i forhold til proteiner en, og det har blitt anslått at mindre enn 30% av valg for alle mål forsøkt har resultert i en aptamer 38. Derfor må man være svært oppmerksom på eksperimentell design og utførelse for å kunne velge en aptamer til et lite molekyl mål.
Den aptamer valgmetoden beskrevet i dette arbeidet er fordelaktig fordi den kan anvendes på små molekyler uten å kreve noen kjemisk modifikasjon som kan endre sine bindende egenskaper. Det er også eluering basert, noe som betyr at siden tHan DNA, snarere enn målet, blir først bundet deretter eluert fra magnetiske kuler etter målet, DNA som samvirker med vulsten matrisen vil ikke bli forsterket for neste seleksjonsrunde fordi bindemidler til molekylet av interesse blir sluppet ut i supernatanten buffer og uspesifikke matrix permer forbli bundet. Omvendt er en negativ-utvelgelsesmetode mot matrisen som er nødvendig for fremgangsmåter som immobiliserer målet til den faste bærer hver runde fordi DNA som samvirker med matrisen vil bli amplifisert i tillegg til mål-bindemidler 1. Den nåværende metoden ble utviklet som en T m begrenset utvalg strategi. Dette betyr at T m av cDNA / pool hybridisering ble holdt nær romtemperatur. Morse benyttet en lignende strategi, men anvendt en 6-mer probe-cDNA med en T m <10 ° C med seleksjonsbetingelser ved 4 ° C 17. Vår søknad var for en biosensing assay utført ved romtemperatur, slik at lengden av cDNA ble justert i henholdly. Dette holder stringens av utvalget lav nok til at potensielle bindemidler ikke går tapt fordi målet bindende samspillet oppstår i et avsidesliggende sted som ikke induserer en konformasjonsendring i stand til å forstyrre cDNA bindende. Imidlertid er partisjone effektiviteten av den foreslåtte fremgangsmåte lav fordi noen sekvenser vil dehybridize utelukkende basert på termodynamikk. I motsetning til dette, Nutiu et al. Anvendt en 15-mer-cDNA, og var bare i stand til å identifisere aptamerer for to av de fire målene, muligens fordi T m av den 15-mer var for høy til å tillate en frigjøring av et lite molekyl target 18. Derfor, mens dagens utvalg strategi vil kreve mange runder for å fjerne bakgrunns sekvenser, ved å kontrollere stringens av utvalget og minimere tap av potensielle permer sannsynligheten for suksess vil bli økt.
Mange forskere nye til aptamer utvalg er uvitende om viktige aspekter knyttet til PCR avpotensielle permer. Syklus optimalisering (avsnitt 4.5) er nødvendig fordi over-amplifikasjon av DNA-biblioteker frembringer uønskede biprodukter (vanligvis større i størrelse) ved høye syklustall, og det ønskede produkt kan forsvinne helt med et overskudd av bare 5 sykluser 39. I tilfelle av over-amplifikasjon av PCR-produkter som ikke lenger representerer de sekvenser som eluerte ved målet, og sjansene for suksess valg blir betydelig redusert. Figur 4 illustrerer et eksempel på en syklus optimalisering fra rundt 5 i dette arbeidet. Den laveste syklus produserer en minimal produkt band, band øker i mengde gjennom åtte sykluser; 10 sykluser bandet begynner en overgang til en høyere størrelse over-amplifikasjonsprodukt, og er nesten utelukkende består av over-amplifisert produkt i løpet av 12 sykluser. En annen detalj som mange forskere uerfaren i SELEX kan overse er at hele bassenget må forsterkes i stor skala PCR forsterkning (punkt 4.6) i granst runde for å redusere tap av bindemidler. Antall unike sekvenser som mulig fra oligonukleotider er 4-N, hvor 4 betegner de fire nukleinsyrebaser, og N er antall baser i tilfeldig region av biblioteket. For dette arbeidet, N = 40, som resulterer i en sekvensene plass på 1,2 x 10 24 mulige unike sekvenser. Den 2,5 nmol av bibliotek som brukes i det første seleksjonsrunde tilsvarer ~ 10 15 molekyler, noe som betyr at hver kopi av DNA er sannsynlig representert i det første basseng som en unik sekvens. Derfor må hele volumet av DNA ble eluert fra kulene ved målet bli amplifisert for å beholde en kopi av hvert potensielle bindemiddel for neste seleksjonsrunde. Når denne første forsterkning har oppstått, flere kopier er tilgjengelig for valg i de neste rundene hvor en homogen løsning antas for prøvetaking.
Konsentrasjonen av målet bør også vurderes nøye i hver runde. Nutiu et al. Brukda konsentrasjon på 1 mM mål gjennom hele utvelgelsesprosessen, og valgt en ATP aptamer med K d = 600 mikrometer 18. Både nåværende arbeid og forskning av Morse 17 begynte med 100 mikrometer mål, avtagende i løpet av utvalget, og resulterte i aptamerer med lave mikromolare slektskap. Nøyaktig hvilke rundt stringens bør økes (lavere target konsentrasjon) avhenger av når berikelse er observert. Et annet kritisk punkt er å bruke riktige negative seleksjons skritt så aptamerer demonstrere spesifisitet til målet molekylet. Hvilke kontroller som er brukt er betinget av det tiltenkte formålet av den valgte aptamer. For eksempel ble aptamer 15-1 konstruert for å fungere som en gjenkjenningselementet i en biosensing assay for kortisol, slik at progesteron ble brukt som en negativ seleksjon molekyl, fordi det er en metabolsk forløper for kortisol som finnes i fysiologiske væsker 40. ATP aptamer valgt av Nutiu et al. </ Em> ikke inkluderte en negativ utvalg skritt, og samhandler med strukturelt lignende molekyler inkludert ADP, AMP, adenosin, og dATP 18.
En endelig notat for vurdering er at AuNP analysen krever ofte betydelig optimalisering for hver aptamer / target par. Looking for volumet av salt som induserer en knapt visuelt merkbar endring mot en blå nyanse etter salt tillegg er et godt utgangspunkt, men justering av startpunktet kan være nødvendig for å observere et svar. Man har også funnet at analysen gir drastisk forskjellige reaksjoner avhengig bufferkonsentrasjon (utvalget buffer kan kreve fortynning fordi den høye saltkonsentrasjonen av buffere fører ofte aggregering) og sammensetning, graden av DNA-dekning (figur 3), prøvepreparering (noen organiske løsningsmidler som brukes for å oppløse målet kan føre til en høy bakgrunn som maskerer målet respons), temperatur, salttype og konsentrasjon, og incubasjon tid (både DNA med AuNP og DNA / AuNP med target). Under fullt optimaliserte forhold, blir resultatet ofte observert med et mål inkubasjonstid <5 min, demonstrere til fordel for en rask målrespons av AuNP biosensing plattformen. For eksempel, i figur 5 inkubasjonstiden av aptamer / AuNP trinnet ble redusert fra O / N (figur 3) i 30 minutter, og saltet ble tilsatt umiddelbart (<10 sekunder) etter at målet tillegg heller enn 20 minutter senere (figur 3 ) ved en lastetetthet av 73 D / NP. Dette økte kortisol respons til ~ 82% høyere enn blindprøven (figur 5A) ved 10 uM målkonsentrasjon versus ~ 40% ved hjelp av de foregående betingelser (figur 3). Dette svaret kan skilles med det blotte øye (Figur 5B). Legg merke til at det lineære området av kortisol deteksjon er annerledes enn ved bruk av de tidligere betingelser, noe som tyder på at disse betingelser kan optimaliseres for en ønsketrekkevidden. Cholsyre og 2-metoksynaftalen (2MNP) kontroller ga ikke en signifikant respons (figur 5A-B). Forskere må være klar over at å redusere disse inkubasjonstid kan rette for økt respons av analytter med AuNP overflaten, som kan bidra til generell forbedret signal (mål) eller bakgrunnen (ikke-target molekyler). Derfor er nødvendig forsiktig AuNP analysen design og ytelse karakterisering for hver aptamer / target par.
Denne fremgangsmåten beskriver en protokoll for valg av små molekyl-struktur-veksling aptamerer som fungerer på en biosensing plattform slik som beskrevet AuNP assay, som krever en konformasjonell endring av DNA for å påvise nærvær av målet. Imidlertid kan denne metoden anvendes for andre biosensor systemer slik som elektrokjemisk eller fluorescens som fungerer på samme forutsetning for praktisk talt alle størrelser målet. Kraften av protokollen kan videreutvikles eksperimentelt vedflere tilnærminger. For det første kan det merkede seg selv potensielt bli forbedret ved å undersøke fremgangsmåter for optimalisering slik som å bestemme den ideelle T m av cDNA / bibliotek hybridisering som gir en vekselvirkning som er svak nok til å samvirke med et lite molekyl målet, men likevel sterk nok til å redusere mengden bakgrunns sekvenser dehybridized utelukkende fra termodynamikk. Dette vil kondensere antall sykluser er nødvendige for seleksjon og sparer tid i arbeidskraft og å redusere forbruket reagens. Ytterligere undersøkelser av modifikasjoner i valget vil være å bestemme de gunstigste konsentrasjoner av perler og DNA, slik at en mangfoldig populasjon av sekvenser er utsatt for målet, spesielt i den første runde. Suksessen til disse proof-of-prinsippet eksperimenter gi et grunnlag for å investere ytterligere ressurser til å optimalisere og tilpasse AuNP buffer analysen til fysiologiske væsker. Det er et legitimt behov for en rask, robust biosensing plattform som kan fuksjon som et diagnostisk verktøy av den fysiologiske tilstand til et individ, og videre utvikling av AuNP assay i humant serum, ville svette eller spytt møter en strøm av dette gap.
The authors have nothing to disclose.
This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dynabeads M280 Streptavidin | Invitrogen | 112.06D | Compatible with DynaMag-2 Magnet |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin |
Streptavidin Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5113-01 | This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | ≥98% |
Progesterone | Sigma | P0130 | ≥99% |
Cholic Acid | Sigma | C1129 | ≥98% |
NanoDrop ND-1000 | NanoDrop | ND-1000 | Replaced by ND-2000 model |
Tris Base | Promega | H5135 | ≥99.9% |
Sodium Chloride | Sigma | S9888 | ≥99.5% |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% |
500 mL Filter System | Corning | 430769 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
DNA Library | Operon | Custom | HPLC purified |
All other DNA | IDT | Custom | Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC |
Thermomixer | Eppendorf | R | Any model with temperature and mixing speed control will work |
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn | Agilent | 600674 | Taq polymerase can be used as well |
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade | Agilent | 200415 | Other brands will work here |
10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer | Agilent | 200532 | This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase |
GeneAmp PCR System | Applied Biosystems | 9700 | Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work |
Agarose-LE | Ambion | AM9040 | ≥99.9% |
Ethidium Bromide | Sigma | E-1510 | Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen |
Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style | Glen Research | 20-0021-01 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe |
Replacement Filters Expedite | Glen Research | 20-0021-0F | 1 µm size |
Illustra NAP-25 Columns | GE Healthcare | 17-0852-01 | Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | ThermoFisher Scientific | 66205 | 2k MWCO used |
Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important |
Sodium Citrate Dihydrate | SAFC | W302600 | We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays |
SpectraMax | Molecular Devices | M5 | Results were similar to Bio-TEK system |
Synergy | Bio-TEK | HT | Results were similar to Molecular Devices system |
HEPES Buffer | Amresco | J848 | Any brand that makes a sterilized product will work |
250 mL Filter System | Corning | 430767 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Other brands will work here |
5 mL Syringe | Becton-Dickinson | 309646 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column |
ThermoEC Minicell Primo | ThermoFisher Scientific | EC320 | Compatible with Power Supply |
Power Supply | Fisher Scientific | FB300 | Compatible with ThermoEC Minicell Primo |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | Flammable liquid |
2 Methoxynaphthalene | Sigma | 148245 | 99% |
Assay Plate | Corning | 3370 | 96-well Flat Bottom, Sterile |