A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.
Små molekyler ger rika mål för biosensing applikationer på grund av deras fysiologiska konsekvenser som biomarkörer för olika aspekter av människors hälsa och prestation. Nukleinsyra aptamers har alltmer tillämpas som igenkänningselement på biosensor plattformar, men att välja aptamers mot småmolekylära mål kräver speciella design överväganden. Detta arbete beskriver modifiering och kritiska steg i en metod som syftar till att välja struktur-växling aptamers till småmolekylära mål. Bindnings sekvenser från ett DNA-bibliotek hybridiserades till komplementära DNA-infångningssonder på magnetiska pärlor separeras från nonbinders via en mål-inducerad förändring i konformation. Denna metod är fördelaktig eftersom sekvenser binder bärmatrisen (pärlor) kommer inte att ytterligare förstärkas, och det kräver inte immobilisering av målmolekylen. Emellertid är smälttemperaturen för infångningsproben och bibliotek hålls vid eller något över RT, sådana att sekvenser thatt dehybridize baserat på termodynamik kommer också att vara närvarande i den överstående lösningen. Detta begränsar effektivt partitioneeffektivitet (förmåga att separata mål bindande sekvenser från nonbinders), och därmed många urvalsomgångarna kommer att krävas för att ta bort bakgrundssekvenser. Den redovisade metoden skiljer sig från tidigare struktur-växling aptamer val på grund av genomförandet av negativa selektionssteg, förenklat övervaknings anrikning och utvidgning av längd infångningssökfragmentet följande urval anrikning för att ge förbättrad stringens. De valda strukturmodifierande omkopplings aptamerer är fördelaktiga i en guldnanopartiklar analysplattform som rapporterar förekomsten av en målmolekyl genom den konformationsförändring av aptamer. Guldet nanoparticle analysen tillämpades eftersom det ger en enkel, snabb kolorimetrisk avläsning som är bra i en klinisk eller utplacerade miljö. Design och optimering överväganden presenteras för analysen som proof-of-principle arbete i buffert för att ge en grund för ytterligare utvidgning av arbetet mot småmolekylära biosensing i fysiologiska vätskor.
Små molekyler har länge setts som spelar viktiga roller i olika biologiska processer såsom fysiologisk toxicitet eller näring, cellsignalering och som läkemedelsbehandling till sjukdoms 1. Olika små molekyler har också föreslagits som biomarkörer som indikerar fysiologiska förhållanden bland annat stress 2,3, trötthet 4, och sjukdom 5. Till exempel, förhöjda kortisolnivåer korrelerar stress vilket kan resultera i minskad fysiologisk prestanda och andra hygienkrav 6-8. Likaså variationer i förhållandet mellan vissa peptider i saliv är prediktiva för trötthet, där fysiologiska manifestationer inkluderar brist på koncentration, försämrad reaktionstid och minskad kognitiv funktion 4. Därför kan utvecklingen av målspecifika biosensorer för att kontrollera nivåerna av små molekyler ger en ovärderlig statistiken för att bedöma hälso- och prestandan hos en individual.
Historiskt har liten molekyl detektering utförts av arbetsintensiva separationstekniker eller genom antikroppsbaserade erkännande 6,7. På senare tid har nukleinsyrasekvenser aptamerer 9,10 dykt upp som igenkänningselement som besitter distinkta fördelar jämfört med antikroppar i specifika tillämpningar. Med sin förmåga att binda ett mål som varierar i storlek från metalljoner 11 till vävnader 12, har aptamers har i stor utsträckning som igenkänningselement i biosensing plattformar 13,14. Jämfört med antikroppar, är aptamers kemiskt syntetiserade, och det är därför enkelt att införa reproducerbara kemiska modifieringar för ytan immobilisering eller rapportering. Aptamerer kan väljas med hög målspecificitet under de önskade förhållanden genom att ändra villkoren för urval används, medan antikroppar är begränsade till fysiologiska förhållanden 15,16. Dessutom aptamerer är kapabla högre ligandtäthet grund thEIR mindre storlek, vilket resulterar i högre mål signalerings verkningsgrad på en biosensor plattform, och den förbättrade stabiliteten hos aptamers möjliggör upprepad användning och långsiktig sensor förvaring 16.
Aptamerer genereras genom ett förfarande som kallas SELEX, där en initial bibliotek av sekvenser utvecklats från 10 13 -10 15 unika molekyler till en berikad final pool som innehåller flera (10 1 -10 2) sekvenser med potential att binda målmolekylen. Den slutliga anrikade poolen därefter sekvenseras och dissociationskonstanterna (Kd) erhålls från bindningsanalyser av de högsta kopietal sekvenser med målmolekylen. Utvecklingen av poolen till en slutlig anrikad population spåras genom att övervaka den procentuella andelen av poolen bindande målet på varje runda, tills maximal anrikning erhålles. Detta sker under ett antal evolutionära omgångar, där bindande sekvenser partitionerad från nonbinders och amplsom du angav användning av polymeraskedjereaktionen (PCR). Förmågan att effektivt partitionera och behålla bindemedel är en av de viktigaste faktorerna för effektiviteten i urvals- och direkt påverkar egenskaperna hos de utvalda aptamers 15. SELEX partitione skede är mer utmanande för små molekyler, eftersom de inte har den storlek eller olika funktionella grupper som stöd fördelningsprocessen av protein mål 1,15. Till exempel har många proteinpartitione plattformar förlitar sig på storlek eller laddning baserad separation, men egenskaperna hos bundna DNA-småmolekylära mål-komplex är i allmänhet inte signifikant annorlunda än för icke-bindande sekvenser, vilket resulterar i ineffektiv partitione 1. Alternativa SELEX partitionemetoder kan innebära immobilisering eller märkning av målet, vilket potentiellt förändra de bindande egenskaperna hos en liten molekyl. Följaktligen till utformning av ett urvalsförfarande genererar aptamers för liten molekyl riktar requires särskild hänsyn.
En mängd olika modifieringar har tillämpats på den ursprungliga SELEX metodik för att förbättra partitione effektivisera förfarandet, förbättra affinitet eller specificitet av sekvenserna i den slutliga poolen, eller göra det mer mottaglig för olika applikationer 15,16. Ett SELEX modifikation kapabla att välja för små molekyler designades för att generera strukturmodifierande omkopplings aptamerer, eller aptamerer som undergår en konformationsförändring vid interagera med målmolekylen 17,18. I ett exempel på detta förfarande, är biblioteket hybridiseras till en kort bit av nonbinding komplementärt DNA (cDNA) immobiliserade på magnetiska pärlor 17. Vid målet bindande, konformationsförändring av bindande sekvenser gör att de kan dehybridize från cDNA, släppa in dem i supernatantlösningen, medan nonbinders förblir hybridiserade till cDNA / pärlor är magnetiskt partitionerad och kasseras. Denna metod är Advanaktiga för små molekyler, eftersom den inte kräver immobilisering eller märkning av målmolekylen att uppnå separation.
Aptamerer som kan struktur-switch besitter en värdefull funktion för varje potentiell biosensor plattform som kräver en förändring i aptamer struktur för att påvisa förekomsten av en målmolekyl. Specifikt kan aptamers kombineras med guldnanopartiklar (AuNPs) för att skapa analyser som funktion baserad på principen strukturen växling för att producera en kolorimetrisk reaktion i närvaro av målmolekyl efter salt utmaning 19,20. I en AuNP analys, den enkelsträngat DNA (ssDNA) aptamer adsorberar initialt till AuNP ytan och skyddar den från salt utmaning. Närvaron av målet inducerar en konformationell förändring i aptamer som exponerar AuNP yta, vilket resulterar i en röd-till-blå färgförändring efter salttillsats. AuNP analyser har också visat att förstärka signalen, där mikromolar affinitet aptamers kan upptäcka mål på nivåer tiopotenser lägre än dissociationskonstanten (Kd) 21. Den här funktionen är särskilt attraktivt för småmolekylära mål, där tillhörighet sträcker vanligtvis från låg mikromolär till millimolära koncentrationer 1,15. Generellt är analysen också snabb och relativt enkel att utföra, uppmuntra ytterligare studier av aptamer-AuNP analyser som biosensordetektionsplattformar.
Målet med detta arbete är att ge en universell protokoll för att välja struktur-växling aptamers till små molekyler för biosensing applikationer som använder stressmarkören kortisol som en representativ molekyl. En ordning AuNP biosensor upptäckt är av intresse på grund av dess enkelhet i drift och kolorimetrisk avläsning, men struktur-växling aptamers är tillämpliga på alternativa sensorplattform utgångar, såsom elektro 22 eller fluorescens 23 som också upptäckt via en förändring i aptamer conformation vid målbindning. Jämfört med tidigare metoder, var flera negativa selektionssteg införlivas i utformningen 17,18, och en enkel UV-baserade system upptäckt anrikning fördes (Figur 1). Detta protokoll står i kontrast med radioligand anrikningsschema detektering används i äldre metoder 17. Den föreslagna metoden inkorporerade också en ökning av längden på cDNA infångningsprober används i urvals att öka partitioneeffektiviteten och effektivt ställa stringensen i urvalet efter maximal anrikning observerades 24. Den avstämda stringens leder till en lägre total procentandel av DNA elueras genom målet i den slutliga poolen, men resulterade i högre kopietal av en sekvens som band med förbättrad affinitet jämfört med det högsta kopietalet sekvens från en tidigare runda. Det högsta kopietalet sekvens från den slutliga poolen applicerades på en AuNP analys för att illustrera att sekvensen var mottaglig för en plattformsom kräver en strukturell förändring för att indikera målet bindande. Denna buffert baserad analys visar att svaret från AuNP analysen kan ändras genom att ändra tätheten av DNA appliceras på ytan, och fungerar som proof-of-principle arbete att ägna framtida forskningsinsatser mot att utveckla små molekyler aptamer baserade AuNP biosensorer i fysiologiska vätskor.
Det faktum att små molekyler är av biologiskt intresse, utan bara utgör 19% av alla aptamers rapporterade gör metoder som utformats för att välja aptamers som är tillämpliga på små molekyler av stor betydelse. SELEX av små molekyler är särskilt utmanande eftersom färre funktionella grupper, strukturella motiv, och yta är tillgängliga för interaktion med sekvenser jämfört med proteiner en, och det har uppskattats att mindre än 30% av markeringar för alla mål försök har resulterat i en aptamer 38. Därför måste man vara extremt medveten om experimentell design och utförande för att framgångsrikt välja en aptamer till en liten molekyl mål.
Den aptamer urvalsmetod som beskrivs i detta arbete är fördelaktig eftersom den är tillämplig på små molekyler utan att kräva någon kemisk modifikation som kan förändra deras bindningsegenskaper. Det är också eluering baserad, vilket innebär att eftersom tHan DNA, snarare än målet, initialt binds därefter elueras från de magnetiska pärlor efter målet, DNA interagera med pärlan matrisen kommer inte att förstärkas för nästa omgång av valet eftersom bindemedel till molekylen av intresse släpps ut i den överstående bufferten och ospecifika matris bindemedel förblir bundet. Omvänt är en negativ-selektionsmetod mot matrisen krävs för metoder som immobilisera målet till den fasta bäraren varje runda grund av att DNA som interagerar med matrisen kommer att amplifieras i sidan av det mål bindemedel 1. Den nuvarande metoden var utformad som en Tm begränsat urval strategi. Detta innebär att Tm av cDNA / pool hybridisering hölls nära till RT. Morse använde en liknande strategi, men tillämpat en 6-mer-cDNA-sond med en Tm <10 ° C med selektionsbetingelser vid 4 ° C 17. Vår ansökan var för en biosensing analys utförd vid RT, så längden av cDNA justeras enligtly. Detta håller stringens av markeringen så låg att potentiella bindemedel inte går förlorade på grund av att målet bindande interaktionen sker i en avlägsen plats som inte inducerar en konformationsförändring som kan störa cDNA bindande. Emellertid är partitione effektiviteten för den föreslagna metoden låg eftersom vissa sekvenser kommer dehybridize enbart baserat på termodynamik. Däremot Nutiu et al. Tillämpat en 15-mer-cDNA, och kunde bara identifiera aptamerer för två av de fyra målen, möjligen på grund av att Tm av 15-mer var för hög för att en frigivning av en liten molekyl mål 18. Därför, medan den aktuella markeringen strategin kommer att kräva många rundor för att ta bort bakgrundssekvenser, genom att kontrollera stringens av markeringen och minimera förlusten av potentiella bindemedel sannolikheten för framgång kommer att höjas.
Många forskare nya till aptamer urval är omedvetna om viktiga aspekter av PCR avpotentiella bindemedel. Cycle optimering (avsnitt 4.5) är nödvändig eftersom över förstärkning av DNA-bibliotek ger oönskade biprodukter (typiskt större i storlek) vid höga cykelnummer, och den önskade produkten kan helt försvinna med ett överskott på endast 5 cykler 39. I fallet med överförstärkning, PCR-produkterna inte längre representerar de sekvenser elueras av målet, och chanserna att urvals lyckas avsevärt minskat. Figur 4 visar ett exempel på cykeloptimering från omgång 5 i detta arbete. Den lägsta cykeln ger en minimal produktband, bandet ökar i mängd genom åtta cykler; vid 10 cykler bandet börjar en övergång till en högre storlek över amplifieringsprodukt, och är nästan helt består av över förstärkta produkten inom 12 cykler. En annan detalj som många forskare oerfaren i SELEX kan förbise är att hela poolen måste förstärkas i stor skala PCR-amplifiering (avsnitt 4.6) i granst runda för att mildra förlusten av bindemedel. Antalet unika sekvenser möjliga från oligonukleotider är 4 N, där 4 betecknar de fyra nukleinsyrabaser, och N är antalet baser i den slumpmässiga regionen av biblioteket. För detta arbete, N = 40, vilket resulterar i en sekvenser utrymme av 1,2 x 10 24 möjliga unika sekvenser. Den 2,5 nmol av bibliotek som används i den första selektionsomgången motsvarar ~ 10 15 molekyler, innebärande att varje kopia av DNA sannolikt representerat i den initiala poolen som en unik sekvens. Därför måste hela volymen av DNA elueras från pärlorna av målet amplifieras att behålla en kopia av varje potentiell bindemedel för nästa omgång av valet. När denna initiala förstärkning har skett, flera kopior kan väljas i följande rundor där en homogen lösning förutsätts för provtagning.
Koncentrationen av målet bör också övervägas noga i varje omgång. Nutiu et al., Användningda koncentration av 1 mM mål under hela urvalsprocessen, och valt en ATP aptamer med Kd = 600 iM 18. Både den nuvarande arbetet och forskningen av Morse 17 började med 100 iM målet, minskar under hela urvalet, och resulterade i aptamers med låga mikromolära tillhörighet. Exakt vilka runt stringens bör ökas (lägre målkoncentration) beror på när anrikning observeras. En annan kritisk steg är att tillämpa lämpliga negativa selektionssteg så aptamers demonstrerar specificitet till målmolekylen. Vilka kontroller används är avhängigt den avsedda tillämpningen av den valda aptamer. Till exempel var aptamer 15-1 avsedda att fungera som ett igenkänningselement i en biosensing analys för kortisol, så progesteron användes som en negativ selektions molekyl eftersom det är en metabolisk prekursor till kortisol som påträffas i fysiologiska fluider 40. ATP aptamer utvalda av Nutiu et al. </ Em> inte innehöll ett negativt urval steg, och samverkar med strukturellt liknande molekyler inklusive ADP, AMP, adenosin, och dATP 18.
En sista anmärkning för övervägande är att AuNP analys kräver ofta betydande optimering för varje aptamer / target paret. Letar du efter den volym av salt som inducerar en knappt visuellt märkbar förändring mot en blå nyans efter salt tillägg är en bra utgångspunkt, men justering av startpunkten kan krävas för att följa ett svar. Vi har också funnit att analysen ger drastiskt olika svar beroende på buffertkoncentration (buffert val kan kräva späd eftersom den höga saltkoncentrationen buffertar ofta orsakar aggregering) och sammansättning, grad av DNA-täckning (Figur 3), provberedning (vissa organiska lösningsmedel som används för upplösning av mål kan orsaka en hög bakgrund som masker rikta respons), temperatur, salt typ och koncentration, och incubationstiden (både DNA med AuNP och DNA / AuNP med målet). Under fullt optimerade förhållanden erhålls typiskt observeras med ett mål inkubationstid <5 min, vilket visar fördelen av en snabb målsvaret av AuNP biosensing plattformen. Till exempel i figur 5 inkuberingstiden av aptamer / AuNP steg minskades från O / N (fig 3) till 30 minuter, och salt tillsattes omedelbart (<10 sek) efter mål tillägg snarare än 20 min senare (figur 3 ) vid en laddningsdensitet av 73 D / NP. Detta ökade kortisolsvaret till ~ 82% högre än den tomma (Figur 5A) vid 10 ^ M målkoncentration kontra ~ 40% med hjälp av de tidigare förhållandena (Figur 3). Denna reaktion kan urskiljas med blotta ögat (figur 5B). Notera att det linjära området för kortisol detektering är annorlunda än att använda de tidigare betingelser, vilket tyder på att dessa villkor kan optimeras för en önskaddetekteringsområde. Cholsyra och 2-metoxinaftalen (2MNP) kontroller gav inte en signifikant respons (figur 5A-B). Forskare måste vara medvetna om att minska dessa inkubationstider kan underlätta ökad respons av analyter med AuNP ytan, vilket kan bidra till övergripande förstärkt signal (mål) eller bakgrund (icke-målmolekyler). Därför är det nödvändigt med noggrann AuNP analys design och prestanda karakterisering för varje aptamer / target paret.
Detta förfarande beskriver ett protokoll för att välja småmolekylära strukturmodifierande omkopplings aptamerer som fungerar i ett biosensing plattform såsom den beskrivna AuNP analysen, som kräver en konformationsförändring av DNA för att detektera närvaro av målet. Dock skulle denna metod kunna tillämpas på andra biosensorsystem såsom elektrokemisk eller fluorescens som fungerar på samma premiss för praktiskt taget alla storlekar målet. Kraften i protokollet kan vidareutvecklas experimentellt genomflera tillvägagångssätt. Först, kan uttagnings själv vara potentiellt förbättras genom att undersöka metoder för optimering såsom bestämning av ideala Tm av cDNA / bibliotek hybridisering som ger en interaktion som är tillräckligt svag för att interagera med en liten molekyl mål, men ändå tillräckligt starka för att minska mängden av bakgrundssekvenser dehybridiserad enbart från termodynamiken. Detta kommer att kondensera det antal cykler som krävs för selektion, vilket sparar tid i arbetskraft och minska reagensförbrukning. Fortsatta undersökningar om modifieringar av val skulle vara att fastställa de mest gynnsamma koncentrationer av pärlor och DNA, så att en mångfaldig population av sekvenser exponeras för målet, speciellt i den initiala omgången. Framgången för dessa proof-of-principle experiment ger en grund för att satsa ytterligare resurser att optimera och anpassa AuNP buffert analys för fysiologiska vätskor. Det finns ett legitimt behov av en snabb, robust biosensing plattform som kan funktion som ett diagnostiskt verktyg för fysiologiska tillstånd hos en individ, och vidareutveckling av AuNP analysen i humant serum, skulle svett eller saliv träffa en denna nuvarande klyftan.
The authors have nothing to disclose.
This research was performed while the author (JAM) held a National Research Council Research Associateship Award at Air Force Research Laboratories. Co-author MW held a Wright Scholar Fellowship supported by the Air Force Office of Scientific Research. This work was supported by Air Force Office of Scientific Research, Air Force Research Laboratory, and Bio-X Strategic Technology Thrust.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dynabeads M280 Streptavidin | Invitrogen | 112.06D | Compatible with DynaMag-2 Magnet |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | Compatible with Dynabeads M280 Streptavidin |
Streptavidin Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5113-01 | This is a high density streptavidin product for ssDNA preparation |
Hydrocortisone | Sigma | H4001 | ≥98% |
Progesterone | Sigma | P0130 | ≥99% |
Cholic Acid | Sigma | C1129 | ≥98% |
NanoDrop ND-1000 | NanoDrop | ND-1000 | Replaced by ND-2000 model |
Tris Base | Promega | H5135 | ≥99.9% |
Sodium Chloride | Sigma | S9888 | ≥99.5% |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fluka | 63068 | ≥98% |
500 mL Filter System | Corning | 430769 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
DNA Library | Operon | Custom | HPLC purified |
All other DNA | IDT | Custom | Capture probes and primers- desalted; Aptamers- HPLC |
Thermomixer | Eppendorf | R | Any model with temperature and mixing speed control will work |
PfuUltra II Fusion HotStart DNA Polymerase, 400 rxn | Agilent | 600674 | Taq polymerase can be used as well |
Deoxynucleotide Mix, PCR-Grade | Agilent | 200415 | Other brands will work here |
10x Cloned Pfu DNA Polymerase Buffer | Agilent | 200532 | This buffer was optimized for PfuUltra II polymerase |
GeneAmp PCR System | Applied Biosystems | 9700 | Any model that allows researcher to open lid for cycle optimization will work |
Agarose-LE | Ambion | AM9040 | ≥99.9% |
Ethidium Bromide | Sigma | E-1510 | Acute toxicity, inhalation; suspected carcinogen |
Empty Synthesis Columns, 1 µm Expedite Style | Glen Research | 20-0021-01 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with syringe |
Replacement Filters Expedite | Glen Research | 20-0021-0F | 1 µm size |
Illustra NAP-25 Columns | GE Healthcare | 17-0852-01 | Any brand with DNA grade resin gel filtration column will work |
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette | ThermoFisher Scientific | 66205 | 2k MWCO used |
Gold(III) chloride hydrate | Sigma | 254169 | 99.999% purity is important |
Sodium Citrate Dihydrate | SAFC | W302600 | We have found that the compound produced from different manufacturers greatly affects AuNP assays |
SpectraMax | Molecular Devices | M5 | Results were similar to Bio-TEK system |
Synergy | Bio-TEK | HT | Results were similar to Molecular Devices system |
HEPES Buffer | Amresco | J848 | Any brand that makes a sterilized product will work |
250 mL Filter System | Corning | 430767 | 0.22 µm cellulose acetate membrane |
UV Spectrophophotometer | Varian | Cary 300 | Other brands will work here |
5 mL Syringe | Becton-Dickinson | 309646 | This model is ideal because of the Luer-Lok fitting to couple with Expedite column |
ThermoEC Minicell Primo | ThermoFisher Scientific | EC320 | Compatible with Power Supply |
Power Supply | Fisher Scientific | FB300 | Compatible with ThermoEC Minicell Primo |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D8418 | Flammable liquid |
2 Methoxynaphthalene | Sigma | 148245 | 99% |
Assay Plate | Corning | 3370 | 96-well Flat Bottom, Sterile |