Este artigo em vídeo ilustra um protocolo abrangente para detectar e quantificar todos os estágios da neurogênese do hipocampo adulto dentro da mesma seção de tecido. Elaboramos um método para superar as limitações da imunofluorescência múltipla indireta que surgem quando anticorpos adequados de diferentes espécies hospedeiras não estão disponíveis.
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Artigo de método
A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neurogênese adulta é altamente regulado, processo multi-estágio em que novos neurônios são gerados a partir de uma célula-tronco neurais ativadas via cada vez mais comprometidos subtipos progenitoras intermediários. Cada um destes subtipos expressa um conjunto de marcadores moleculares específicos que, em conjunto com os critérios morfológicos específicos, podem ser usadas para a sua identificação. Tipicamente, técnicas de imunofluorescência, são aplicadas envolvendo anticorpos específicos de subtipo em combinação com marcadores de proliferação exo- ou endógenos. Descrevemos aqui immunolabeling métodos para a detecção e quantificação de todas as fases da neurogénese no hipocampo adulto. Estas incluem a aplicação de análogos da timidina, perfusão transcardial, processamento de tecidos, recuperação antigênica induzida por calor, ABC imunohistoquímica, múltiplos de imunofluorescência indireta, microscopia confocal e quantificação de células. Além disso, apresentamos um protocolo de imunofluorescência sequencial de múltiplas que contorna problemas usually decorrente da necessidade do uso de anticorpos primários levantados nas mesmas espécies hospedeiras. Ele permite a identificação precisa de todos os subtipos progenitoras do hipocampo, juntamente com um marcador de proliferação dentro de uma única seção. Estas técnicas são uma ferramenta poderosa para o estudo da regulação dos diferentes subtipos progenitoras em paralelo, o seu envolvimento em patologias cerebrais e o seu papel em funções específicas do cérebro.
Introdução
Duas regiões do cérebro constitutivamente gerar novos neurónios ao longo da vida, a zona subventricular dos ventrículos laterais e na zona subgranular (SGZ) do giro dentado do hipocampo (DG). Os neurônios recém-nascidos derivam de células progenitoras neurais e passam por diferentes estágios de desenvolvimento morfológico e fisiológico antes de atingirem a maturidade 1,2. A partir de uma glia-like radial células estaminais lentamente dividindo (tipo 1) estágios consecutivos de trânsito amplificando surgem células progenitoras intermediários. Os subtipos mais indiferenciadas (tipo 2A e tipo 2b) tem uma forma irregular, processos com tangenciais curtas. Gera....
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Protocolo
NOTA: Todos os procedimentos que envolvem animais vivos foram realizadas em conformidade com a directiva EC 86/609 / CEE orientações sobre cuidados e uso de animais de laboratório e aprovado pelo comitê de ética local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. injeção intraperitoneal de timidina Analogs
- Pesar animais o dia antes da injeção. Calcule a quantidade de timidina analógica necessária para todas as injecções planejadas no dia seguinte, bem como o volume de injecção individuais ajustados ao peso de uma solução estoque de 10 mg / ml.
- Prepare / ml solução estoque timidina 10 mg. <....
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Resultados
Foram aplicados os métodos descritos acima para quantificar e caracterizar células-nascidos nas pós-natais e adultos hipocampo. Portanto, nós utilizamos wildtype e neurogênese deficiente ciclina D2 vazar (Ccnd2 KO) alojados em condições conhecidos por afetar a taxa de neurogênese (ou seja, o ambiente enriquecido, EE) 13,14. A coloração imuno-histoquímica contra DAB ou Ki67, BrdU, CldU ou IdU revelou consistentemente diferenças no número de células entre os recém-nascidos de tipo selvagem e K.......
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Discussão
A quantificação e identificação de subpopulações de células-nascidos é uma questão central na pesquisa neurogênese adulta. Combinando marcadores de proliferação e de anticorpos contra as proteínas expressas durante fases específicas da neurogênese adulta permite a detecção imuno-histoquímica destas subpopulações. Alguns dos anticorpos ou combinações de anticorpos específicos requerem condições de coloração.
Rotulagem de divisão de células com análogos da timidina sintéticos ainda é o padrão .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem a S. Tausch pela excelente assistência técnica. O trabalho foi apoiado pelo BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) e DFG (FOR1738).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Administração análoga de timidina | |||
| 5-Bromo-2′-desoxiuridina, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | tóxico (mutagênico, teratogênico) |
| 5-Cloro-2′-desoxiuridina, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | tóxico (mutagênico, teratogênico) |
| 5-Cloro-2′-desoxiuridina, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | tóxico (mutagênico, teratogênico) |
| 5-Iodo-2′-desoxiuridina, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | tóxico (mutagênico, teratogênico) |
| Preparação de tecidos | |||
| Isoflurano-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldeído em pó (PFA) | Riedel-De Hä pt | 16005 | bomba de |
| perfusão tóxica e inflamável PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Tubulação de laboratório Masterflex Tygon, Ø 0,8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Agulha de alimentação, reta, 21 G, ponta verde-oliva de 1,75 mm, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| Micrótomo de congelamento Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| Placas multipoços de cultura celular de 24 poços | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine vaporizador | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm inserções de membrana de malha de poliéster | Corning | 3479 | pré-carregado em placas de cultura de 6 poços |
| Inserções de membrana de malha de poliéster Netwell 15 mm | Corning | 3477 | pré-carregado em placas de cultura de 12 poços |
| Kit de suporte de plástico Netwell de 6 poços | Corning | 3521 | para inserções de membrana de malha de poliéster de 24 mm Kit |
| de suporte de plástico Netwell de 12 poços | Corning | 3520 | para inserções de membrana de malha de poliéster de 15 mm Kit |
| Vectastain Elite ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (hidrato de cloridrato de 3,3&e;-diaminobenzidina) | Sigma-Aldrich | D-5637 | cancerígeno, sensível à luz |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Anticorpos primários | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requer recuperação de epítopos |
| Coelho α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Anticorpos | R1091P | 1:300 |
| IgG1 de camundongo α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requer recuperação de epítopos |
| Cobaia IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| Rato IgG2a α- BrdU (ascite) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | para detecção de BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rato IgG2a α-BrdU (purificado) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | para detecção de CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| Mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| mouse IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | Para detecção de IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| Anticorpos secundários | |||
| IgG de &alfa;-cobaia de burro (H+L)-Biotina | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| IgG de &alfa;-rato de burro (H+L)-Biotina | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| IgG de &alfa;-camundongo de burro (H+L)-Biotina | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| IgG de &alfa;-rato de cabra (H+L)-Alexa Fluor 488 | Sondas Moleculares | A11006 | 1:250 |
| Burro α-cabra IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Sondas Moleculares | A11055 | 1:250 |
| Burro α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| Burro α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| Burro &alfa;-cobaia IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| Burro &alfa;-rato IgG (H+L)-Rodamina Vermelho-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| Burro &alfa;-coelho IgG (H+L)-Rodamina Vermelho-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| Burro &alfa;-cobaia IgG (H+L)-Rodamina Vermelho-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Estreptavidin-rodamina Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| Cabra α-coelho IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, funciona apenas com coelho α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Sondas Moleculares | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Sondas Moleculares | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragmento de burro α-camundongo IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragmento de burro α-coelho IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Soro normal de burro | Merck Millipore | S30 | |
| Soro normal de coelho | Dianova | 011-000-010 | |
| Soro normal de cabra | Dianova | 005-000-001 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | substituto de xileno não tóxico |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | meio |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopia | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopia | ||
Referências
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus.....
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Reimpressões e permissões
