Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.
Mange progressive neurologiske sykdommer hos mennesker, slik som epilepsi, krever pre-kliniske dyremodeller som langsomt utvikler sykdommen for å teste intervensjoner på ulike stadier av sykdommen. Disse dyremodeller er spesielt vanskelig å gjennomføre i umodne gnagere, en klassisk modell organisme for laboratoriestudie av disse lidelsene. Opptak kontinuerlig EEG hos unge dyremodeller av beslag og andre nevrologiske lidelser presenterer en teknisk utfordring på grunn av den lille fysiske størrelsen av unge gnagere og deres avhengighet av demningen før avvenning. Derfor er det ikke bare et klart behov for forbedring av pre-klinisk forskning som vil bedre å identifisere slike behandlinger som er egnet for oversettelse til klinikken, men også et behov for nye enheter i stand til å ta opp kontinuerlig EEG i umodne rotter. Her beskriver vi teknologien bak og viser bruk av en ny miniatyr-telemetrisystem, spesielt konstruert for bruk i umodne rotter or mus, som også er effektive for bruk hos voksne dyr.
Den eldste – og fortsatt den mest brukte – teknikk for opptak biopotentials i hjernen er elektroencefalogram (EEG). Den brukes klinisk for nevrologiske abnormiteter, inkludert beslag deteksjon 1, lokalisering av anfall foci to, og diagnostisering av hjernerystelse 3,4. Denne teknikken er også mye brukt for å gi grunnleggende informasjon om mekanismene for søvn og å diagnostisere søvnforstyrrelser 5,6.
Som i den kliniske diagnose av epilepsier, har EEG blitt uunnværlig for translasjonell forskning i dyremodeller av både genetiske og ervervede epilepsi. I gjeldende forskningssøknader, "fast" eller "tethered" opptak er standard, og er rutinemessig utført hos voksne gnagere i uker av gangen 7. Men elektrisk støy, bevegelse gjenstander, og risikoen for at tethered dyr vil skade seg selv ved å trekke i kabelen har lange compromised disse eksperimentene. Derfor, for å forbedre eksperimentelle forhold og suksessrate, må vi utvikle nye teknologier som ville tillate for eliminering av den kablede grensesnittet mellom dyr og instrumentering. Den mest åpenbare område i utvikling er design og implementering av telemetri systemer som gjør det mulig for høykvalitets opptak, og samtidig opprettholde en lang levetid og minimere ubehag for dyr fag. Redusere den fysiske størrelsen på disse enhetene vil gjøre translasjonsforskning i neonatale og juvenile gnager modeller av nevrologiske lidelser.
Lave kanal-count EEG opptak i rotter er ansatt i stor utstrekning for å utvikle nye behandlingsformer for å undertrykke epileptiske anfall i stand til oversettelse til mennesker. Opptak fra en eller flere områder for en lengre periode åpne mange muligheter for å bruke gnagermodeller for epilepsi i translasjonell forskning. Mye av moderne forskning på dette området har som mål å hindre forekomsten av kronisk Seizures eller utviklingen av epilepsi (dvs. epileptogenesis), og slike forskningsinnsats krever omfattende om ikke kontinuerlig EEG-overvåkning for å bestemme effektiviteten av den foreslåtte behandlingen 8; en liten, enkel, telemetrisk system med én, to eller fire kanaler som opererer mellom 0,1-100 Hz per kanal vil sterkt fremme denne type translasjonell forskning. Elektrografisk anfall oppstår ofte med minimale atferd (sikkert uten kramper), som begrenser nytten av analyser basert på beslag atferds. Strategien med å kombinere EEG opptak og samtidig videoovervåking tillater en mulighet til å fange hvert anfall; og dessuten disse analytiske tilnærminger kan tillate kvantitativ vurdering av interiktal toppene som oppstår i epileptiske hjernen mellom "ictal" (eller anfall) hendelser 9. Videre, muligheten til å få en kontinuerlig høy kvalitet, lave artefakt EEG opptak, hvor trådløs teknologi er genereltoverlegen, vil gi rom for utvikling av bruk av PC-baserte algoritmer for å studere spesifikke EEG-kurver (f.eks theta, gamma), samt automatisk registrering av anfall, noe som reduserer arbeidsmengden eksperimentator.
Den primære preklinisk modell for å studere kronisk epilepsi etter hjerneskade er den voksne rotte eller mus, enten gjennom en chemo-konvulsiv (dvs. kainsyre eller pilokarpin) eller elektrisk indusert status epilepticus (SE), som etterfølges av kronisk epilepsi. Under disse forholdene, kan alvorlige kramper i forbindelse med SE eller de påfølgende beslag i epileptiske dyr føre til skader fra dyret rive eller trekke i fortøyningen og løsne skruene som holder å feste en headcap. Til syvende og sist er det dette problemet som regel avslutter disse eksperimentene, og likevel behovet for å skaffe langsiktige høyoppløselige EEG poster for eksperimenter som tar sikte på å utvikle nye behandlingsformer for kroniskeepilepsi er det viktigste. I tillegg, bolig, overvåking og analyse av data fra langsiktig implantert dyr er en betydelig investering i både direkte kostnader og etterforsker tid; derfor kan tidlig avslutning av forsøket medføre betydelige kostnader til forskerne. Som disse modellene av epilepsi fremgang, beslag vanligvis blitt hyppigere og mer alvorlige 10-12, noe som øker sannsynligheten for at dyr blir skadet, akkurat som sin nytteverdi for å utvikle nye behandlingsformer blir størst. Disse dyrene kan rutinemessig utvikle dusinvis av krampeanfall per dag, som ofte oppstår i klynger 13.
Sannsynligvis en av de viktigste utviklingen i biomedisinsk vitenskap har vært bruk av genet målretting i musemodeller. Denne tilnærmingen har tillatt, og vil fortsette å tillate utvikling av dyremodeller av genetisk epilepsi som reproduserer faktiske humane syndromer 14-16. Genetiske manipulasjoner kan foretas somproof-of-prinsippet terapi for å undertrykke epileptiske anfall eller blokkere utviklingen av epilepsi etter hjerneskade 17-20. Denne type forskning vil dra dramatisk fra evnen til å utføre høy gjennomstrømming kontinuerlig opptak av EEG. For tiden er det mulig å ta opp fra mus med enten tethered eller telemetri systemer; Men utfordringene med å skaffe høy kvalitet artefakt-free opptak er vesentlig vanskeligere enn rotter, og ofte dette krever ulike former for ryggsekker som mus kontinuerlig forsøker å fjerne. Stress kan øke anfalls alvorlighetsgrad, frekvens og / eller varighet, og derfor vil til slutt endre epilepsi av forsøksdyrene, og dermed blander sammen studien. En liten, lett, lav profil miniatyr telemetri system vil lette opptak av langsiktig EEG fra genetiske musemodeller av sykdom hos mennesker.
I tillegg til de ovenfor beskrevne problemene, innspilling EEG i umodne gnager modells av sykdom har sin egen unike sett av utfordringer. Umodne dyr kan veie så lite som 6 g (P8 mus) til 17 g (P6 rotte). Det er nesten umulig å lage serie multi-dagers tethered EEG opptak på grunn av økt stress fra fortøyningen og manglende evne til å tillate naturlig oppdrett av valpen ved demningen. Inntil dyrene er avvent, må de forbli i omsorgen av demningen. Dammen er utsatt for å ødelegge noen ekstern kontakt forsamlingen på valpen, avslutte valpen, og i noen tilfeller si opp hele kullet. Videre gjør den umodne gnager skallen det vanskelig å montere noen elektrode søyle til skallen med mekanisk integritet. Disse utfordringene, som er unike for umodne gnagere, krever en ny løsning for å lage robuste, langsiktige elektrografisk opptak. Her har vi fokus på å demonstrere implantasjon og registrering av EEG ved hjelp av en roman miniatyr trådløs sender og presentere tre proof-of-prinsippet eksperimenter som eksempler for bruk av miniatyr trådløs telemetri system: 1) immoden rotteunge modell av hypoksi-ischemi, 2) voksne mus behandlet med DFP for å indusere status epilepticus og påfølgende spontan beslag, og 3) genetisk modell av vaskulære misdannelser kavernøse som resulterer i anfall og død hos voksne mus.
Miniatyr trådløs telemetri system er designet for å møte fire hoved krav: (1) minimal invasiv kirurgisk implantering; (2) kompatibilitet for boliger av gnager unger med demningen og kullsøsken; (3) lavt strømforbruk på enheten, og dermed gir for måneder med kontinuerlig overvåkning uten kirurgisk re-implantasjon; og (4) evne til å ta opp høykvalitets EEG-kurver med minimal bevegelse gjenstander. Den trådløse senderen veier <0,6, 2,3 og 4 g og er <0,3, 0,8 og 1,4 cm 3 avhengig av batteriet med en grunnflate på 5 x 7, 7 x 9, eller 7 x 12 mm som monteres enkelt i skallen av dyret med cyanoakrylat gel. Ingen bein skrue ankere for å sikkert feste enheten tilskallen, redusere antall hull som må bores i skallen, og operasjonen tid. Anordningen er i stand til å forsterke to kanaler med EEG eller lokale feltpotensialer fra dype strukturer i hjernen, slik som i hippocampus, i over to uker, to måneder eller 6 måneder i denne konfigurasjonen. Den lille størrelsen på den trådløse senderen reduserer risikoen for infeksjon, øker dyr mobilitet, og til slutt reduserer morbiditet og mortalitet som ellers øker den tid, penger og antall dyr som trengs for et eksperiment. Alt av elektronikk og batteri blir puttet i medisinsk-grade epoxy som gjør at enheten vanntett og tøff, hindrer demningen fra å tygge på senderen som ellers kunne gjengi enheten ubrukelig. I motsetning til radiofrekvenssendere, bruker telemetrisystemet kapasitiv kopling mellom sender og en mottakerantenne som sitter under dyrets bur, slik at brukeren kan holde dyr i standard gnager boliger. Flere kanaler recording tillate opptak av multimodale biopotentials, for eksempel elektro og elektroencefalogram. Dyremodeller av komorbiditet vil ha nytte av muligheten til å ta opp biopotentials løpet oppførsel 21-23. Kombinere atferd med EEG overvåking vil gi forskere med et bedre verktøy for forskning og pre-kliniske studier.
Det kan være svært dyrt å gjøre langsiktige elektrografisk opptak i små dyremodeller av sykdom. Ved å stole på enkle elektriske kretser og understreker lavt strømforbruk, har vi vært i stand til å skape en sender systemet (figur 1 og 2) som reduserer kostnadene for langsiktig overvåking eksperimenter. Den totale kostnaden for en 6 måneders overvåking eksperiment kan være så lavt som $ 470, pluss kostnaden av dyret (~ $ 1,5 dyr per diem, $ 200 sender). Den lille størrelsen på senderen tillater kontinuerlig uavbrutt elektrografisk opptak i små dyr, prekliniske modeller av sykdom hos mennesker, som er svært vanskelig å få tak i med eller bundet radio-frekvensbaserte trådløse registreringssystemer (figur 4). Endelig reduserer skallen monterte typen av senderen operasjonen tid og påkjenning på dyr som ellers kan kompromittere et eksperiment. Her viser vi proof-of-prinsippet eksperimenter fra tre different eksperimentelle modeller av anfall: perinatal hypoksi-iskemi 13, 27, 28 i en rotteunge (figur 4), DFP-indusert status epilepticus (figur 5) og beslag i en genetisk-indusert modell av svamp vaskulære misdannelser (figur 6).
Muligens den mest kritiske aspektet for å skaffe gjenstand frie, langsiktige elektrografisk opptak er å verifisere uhemmet elektrode tilgang til kortikal regionen av interesse (figur 4-6). Dette omfatter den felles referanse / jordingselektrode. Spesielt kritisk er å feste senderen til skallen for epidural EEG applikasjoner. Under denne prosessen er det mulig å belegge utilsiktet spissen av elektrodene med cyanoakrylat gitt svært kort lengde av elektrodene. Coating elektrodene i cyanoacrylate kan dempe EEG-signaler eller helt isolere dem i worst-case scenario. Tilsvarende, mangel på god elektrisk forbindelse between den felles referanse / bakken og dyrets hjerne vil hindre riktig drift av differensialforsterkeren i senderen, noe som resulterer i en elektrisk "støy" utgangssignal. Ofte etter operasjonen, signaler av god kvalitet kan bli svekket i opp til 48 timer på grunn av ødem som omgir graden hull i skallen. Som ødem avtar, signaler generelt bedre. Dette kan unngås ved å plassere elektrodene på overflaten av hodet uten å gjøre Burr hull. Konsekvensene av denne fremgangsmåte er økt potensial til å belegge elektrodene med cyanoakrylat, redusert høyfrekvente aktivitet på grunn av mikro elektriske egenskapene til skallebenet, og potensialet for elektrisk å isolere den felles referanse / første gjengivelses støy i signalene. Praktisere korrekt plassering av elektrodene kan gjøres med et tynt stykke av tre eller finer som etterligner tykkelsen av mus eller rotte skalle. Resultatene som presenteres i dette manuskriptet illustrerer quaheten av opptak som kan oppnås ved hjelp av trådløs telemetri teknologi.
Kirurgisk implantering ved hjelp av metoden beskrevet heri kan ta så lite som 10 minutter, avhengig av kompleksiteten av operasjonen. For kirurgisk tilgang til dype strukturer i hjernen, slik som CA1 regionen av hippocampus, er det best å feste senderen til en mikromanipulator montert på en stereotaksisk ramme. Mikromanipluatoren vil gi kirurgen med nøyaktigheten til implantatet senderen ifølge publiserte stereotaksiske Koordinatene i atlas av mus 29 og rotte 30 hjerner. Dette kan gjøres ganske enkelt ved å overvinne en del av kanyle slangen til senderen med cyanoakrylat, og deretter montering av kanylen i den mikromanipulator. Mikromanipulator kontroll av x, y, og z-koordinatene vil gi ytterligere stabilitet ved montering av transmitteren til skallen før suturing huden lukket. Tilsetningen av benskruer rundt perimeter av transmitteren kan hjelpe til å forankre senderen til skallen, selv om de ikke er nødvendig. Benskruer kan være effektive, men i visse dyremodeller av kramper og epilepsi, for eksempel litium-pilokarpin-behandlede voksen rotte. Disse dyrene har en tendens til å ha spontane epileptiske anfall med intens motorisk aktivitet som kan skade senderen under anfallet. Ytterligere kompleksitet kan tilsettes til disse eksperimentene. For eksempel, er senderen kompatibel med mange forskjellige modeller av traumatisk hjerneskade, for eksempel kontrollert cortical innvirkning 31. Holdbarheten av senderanordningen ble testet ved implantering av dyr med sendere ved P7, og deretter boliger dem i dyrefasilitet. Etter 12 måneder, de fleste av implantater forble intakt på skallen. Når dyr ble avlivet, hodeskaller syntes å være normal og senderen ble innebygd i skallebenet, som krever betydelig kraft for å pakke den ut. Vær forsiktig når du dype strukturer i hjernener studert; som vokser i hjernen, og elektrodene forblir stasjonære, vil den endelige stilling av elektrodene kan forventes å endre seg. For de teknikker som er beskrevet her, ble elektrodene vanligvis posisjonert over dura, som tillot både i hjernen og hodeskallen til å vokse og for elektrodene å forbli i sine opprinnelige posisjoner. Den begrensende faktoren i hvor lenge senderen kan brukes er batteristørrelsen (dvs. før batteriet går tomt).
Et selvstendig monolittisk konstruksjon (dvs. transmitteren er innleiret i harde epoksy) av senderens huset gir seg til bruk med umodne pups plassert med demningen og deres kullsøsken. Ofte co-boliger implantert dyr med kablede stagene resultater i ødeleggelsen av den implanterte maskinvare eller kannibalisering av valpene ved demningen. Den glatte vegger formen på senderen gjør det mulig for implantasjon med nesten ingen maskinvarefeil eller tap av unger på grunn av kannibalisering.
<p class = "jove_content"> The lavt strømforbruk kapasitiv-coupled overføringssystem i dette systemet egner seg godt for bruk i mange ulike eksperimentelle scenarier som plassering i et temperaturkontrollert inkubator eller for bruk med eksperimentelle apparater, for eksempel plethysmography kamre. Likeledes kan formen av mottakerantennen bli manipulert til å passe inn i mange forskjellige adferds miljøer, for eksempel forhøyet T-maze.The området til senderen er bare noen få inches som senderen må være i stand til å "drive" (kapasitivt par å) mottakerantennen og er avhengig av dyret for å bli plassert i standard gnager bur eller en passende bur som omfattes av mottakerantennen flateareal. Senderen fungerer som en pol av et elektrisk felt, mens kroppen til dyret fungerer som en annen pol. Feltet er slik at visse orienteringer, så som 90 ° ut-av-fase med mottakerantennen, vil mislykkes i å drive mottakerantenne som resulterer i en "drop out". Dette er en ganske sjelden forekomst. Fremtidig arbeid med denne teknologien vil tillate opptak fra flere dyr i samme bur som vil redusere boarding kostnader og gir mulighet for sosial interaksjon. Videre utvikling vil medføre økning av antallet kanaler, inkludert temperatur, og electromyogram. Den aktuelle utforming av innretningen gir en båndbredde som er optimalisert for omkoding av klassisk EEG band, som ikke er egnet for registrering av raske krusninger eller høyfrekvente svingninger. I fremtiden, kan anordningen modifiseres til å ta opp de høyfrekvente komponenter av signalet, men på bekostning av batteriets levetid. Forskjellige typer av transdusere vil omfatte blodtrykk og trykk-volum, og til og med konstruksjon av en sender elektrodearrangement til bruker-spesifiserte dimensjoner i henhold til stereotaktiske koordinatene til de ønskede strukturer i hjernen.The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert gjennom National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag R43 / R44 NS064661.
Sterile Surgical Gloves | Protective Industrial Products | 100-3201 PF | Power Free Sterile Latex Surgical Glove |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | |
Scalpel Blade #15 | FST | 10015-00 | |
Fine Scissors | FST | 14090-09 | |
Burr tool | Ram Products, Inc. | Microtorque II | |
Fine burr | FST | 19007-07 | |
Aneurism clip | ROBOZ | RS-5422 | |
Toothed Forceps | FST | 11022-14 | |
Cotton-Tipped applicators | McKesson | 24-103 | |
Needle Driver | WPI | 521725 | Olsen-Hegar Needle Holder |
Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 4541 | |
Cyanoacrylate accelerant | Henkel | Loctite 7452 | |
Suture | Ethicon | Vicryl RB-1 J304 | |
Elecrocautery disposable | Bovie | AA01 | Fine Tip |
Surgical Tray | FST | 20311-21 | |
Epitel Receiver Base | Epitel Inc | N/A | |
Epitel wireless transmitter | Epitel Inc | N/A | |
Biopac digitizer | Biopac | MP-150 | |
PC-compatible computer |