عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و<em> فيفو السابقين</em> زراعة الخلايا
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
الجلد البشري لديه وظيفة حاجز الهامة ويحتوي على العديد من الخلايا المناعية التي تساهم في توازن الأنسجة والحماية من مسببات الأمراض. وبما أن الجلد هو سهل نسبيا للوصول إلى ذلك، فإنه يوفر منصة مثالية لدراسة الآليات التنظيمية المناعة الطرفية. خلايا مناعية المقيمين في صحي سلوك الجلد الترصد المناعي، ولكن أيضا تلعب دورا هاما في تطوير الأمراض الجلدية الالتهابية، مثل مرض الصدفية. وعلى الرغم من الأفكار الناشئة، فهمنا للبيولوجيا الكامنة وراء العديد من الأمراض التهابات الجلد لا تزال محدودة. هناك حاجة لنوعية جيدة السكان (واحد) خلية معزولة من عينات الجلد تحتاج فحص. وحتى الآن، إجراءات العزل قد يعرقل بشكل خطير بسبب عدم الحصول على عدد كاف من خلايا قابلة للحياة. كما تأثرت العزلة وتحليلها لاحقا من قبل ضياع معالم خلية نسب المناعة، ويرجع ذلك إلى إجهاد ميكانيكي والكيميائية الناجمة عن إجراءات التفكك الحالية للحصول علىتعليق خلية واحدة. هنا، نحن تصف طريقة تعديلها لعزل الخلايا التائية من كلا صحي وتشارك جلد الإنسان الصدفي عن طريق الجمع بين الميكانيكية التفكك الجلد باستخدام dissociator النسيج الآلي والعلاج كولاجيناز. هذه المنهجية يحافظ على التعبير عن معظم علامات النسب المناعة مثل CD4، CD8، Foxp3 وCD11c وعلى إعداد تعليق خلية واحدة. وترد أمثلة ناجحة عزل خلايا CD4 + T والمظهرية لاحق والتحليل الوظيفي.
Introduction
الجلد، مثل الواجهة الأساسية بين الجسم والبيئة، ويوفر خط الدفاع الأول ضد المادية الخارجية والكيميائية والبيولوجية الشتائم مثل جرح والأشعة فوق البنفسجية والكائنات الحية الدقيقة. يتألف الجلد قسمين رئيسيين، البشرة والأدمة، ويحتوي على مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية بما في ذلك خلايا لانغرهانس، الضامة، والخلايا الجذعية (DCS)، وحوالي 20 مليار خلية التائية الذاكرة، ما يقرب من ضعف العدد الحالي في حجم الدم كله 1 ، 2. وهناك مجموعة متزايدة من البيانات يدعم الفكرة القائلة بأن الجلد لديه وظائف مناعية أساسية، سواء خلال توازن الأنسجة وفي مختلف الحالات المرضية. ويعتقد أن الخلايا المناعية المقيمين في الجلد الطبيعي لإجراء الترصد المناعي (3) ولقد ثبت أنها تلعب دورا في تطور الاضطرابات الالتهابية مثل الصدفية 4. في جلد الآفات الصدفي، تسلل على حد سواء CD4 + و CD8 + وكانت خلايا تي التوليدerved وتبين أن نسبة CD4 و CD8 يختلف باختلاف الحالة المرضية 5. ومع ذلك، هؤلاء السكان من خلايا يصعب دراسة لتقنيات الحالية تسمح للعزل الخلايا قليلة فقط.
التقنيات المستخدمة حاليا على نطاق واسع لتي زنزانة انفرادية من الجلد البشري الجمع الميكانيكي تفكك الجلد مع العلاج الأنزيمية. ومفروم خزعات الجلد البشري على نطاق واسع وحضنت مع الانزيمات مثل التربسين، كولاجيناز و / أو EDTA 6-8. وبالنظر إلى أن الجلد هو الأنسجة الحاجز الذي هو مقاومة عالية للقوات الشد وتفصيل الميكانيكية، والأساليب المتبعة في تي العزلة خلية تنتج عدد قليل جدا من الخلايا، وحتى انخفاض أعداد خلايا قابلة للحياة، الأمر الذي يجعل فيفو السابقين الثقافة خلية من هؤلاء السكان خلية صعبة و التحدي.
هنا، ونحن التقرير طريقة تعديلها لعزل الخلايا الليمفاوية من كلا صحي وتشارك جلد الإنسان الصدفي عن طريق الجمع بين ميكانالتفكك كال من الجلد باستخدام dissociator النسيج الآلي بدلا من الأسلوب المعمول بها تنميق على نطاق واسع، جنبا إلى جنب مع عملية الهضم الأنزيمي تستخدم كولاجيناز. وقد لوحظت مختلف مجموعات فرعية الخلايا المناعية قابلة للحياة بما في ذلك البلدان النامية وخلايا T بعد إعداد تعليق وحيد الخلية. أهمية التعبير عن علامات سطح CD3، CD4 و CD8 والحفاظ عليها جيدا. خلايا أعدت وبالتالي، نحن على استعداد لاستخدامها في السابق مزارع الخلايا الحية أو تحليل تدفق cytometric. واستخدمت هذا البروتوكول بنجاح لتحليل خزعات الجلد واحدة (4 مم) المستمدة من جلد الآفات من مرضى الصدفية. وأظهرت النتائج أن الجلد المقيمين خلايا المريض تي تنتج السيتوكينات الالتهابية أكثر مثل IL-17 و IFNγ بالمقارنة مع المتطوعين الأصحاء 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقدم بروتوكول لعزل كفاءة خلايا T مقيم الجلد من خزعات الجلد البشري. وميزة هذا البروتوكول هو عزل أعداد كبيرة نسبيا من الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة، ومعربا عن علامات سطح ذات الصلة. وكانت مجموعات فرعية الخلايا التي تم تحديدها: CD11c و+ البلدان النامية، وخلايا …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تفضلت خزعات الجلد من مرضى الصدفية الدكتور أندرياس Koerber (قسم الأمراض الجلدية في جامعة إيسن، ألمانيا) بعد موافقة شفهية أو مكتوبة علم للاستخدام العلمي.
ويدعم XH أيضا NSFC 61263039 و11101321 NSFC.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
Referências
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
