Lymfocyt Isolering fra menneskehud for Fænotypisk Analyse og<em> Ex vivo</em> Cell Culture
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
Menneskelig hud har en vigtig barriere funktion og indeholder forskellige immunceller, der bidrager til vævshomeostase og beskyttelse mod patogener. Da huden er relativt let at få adgang til, det giver en ideel platform til at studere perifere immun reguleringsmekanismer. Immune residente celler i sund hud adfærd immunosurveillance, men også spille en vigtig rolle i udviklingen af inflammatoriske hudsygdomme, såsom psoriasis. Trods nye indsigter, er vores forståelse af biologien bag forskellige inflammatoriske hudsygdomme stadig begrænset. Der er behov for god kvalitet (single) cellepopulationer isoleret fra biopsi hudprøver. Hidtil har isoleringsprocedurer blevet alvorligt hæmmet af en mangel på at opnå en tilstrækkeligt antal levedygtige celler. Isolering og efterfølgende analyse er også blevet påvirket af tabet af immun celle afstamning markører, som følge af den mekaniske og kemiske stress forårsaget af de nuværende dissociation for at opnåenkelt cellesuspension. Her beskriver vi en modificeret fremgangsmåde til isolering T-celler fra både sundt og involverede psoriatisk menneskehud ved at kombinere mekanisk hud dissociation anvendelse af en automatiseret væv dissociator og collagenase behandling. Denne metode bevarer udtryk for de fleste immune afstamning markører såsom CD4, CD8, Foxp3 og CD11c på udarbejdelsen af enkelte celle suspensioner. Eksempler på vellykket CD4 + T-celle isolation og efterfølgende fænotypisk og funktionel analyse er vist.
Introduction
Huden, som den primære grænseflade mellem kroppen og miljøet, giver den første linje i forsvaret mod ydre fysiske, kemiske og biologiske fornærmelser såsom såret, ultraviolet stråling og mikroorganismer. Hud omfatter to hovedrum, epidermis og dermis, og indeholder en række af immunceller, herunder Langerhans celler, makrofager, dendritiske celler (DC'er), og omkring 20 milliarder hukommelses-T-celler, næsten dobbelt så mange til stede i hele blodvolumen 1 , to. En voksende mængde af data støtter den opfattelse, at huden har væsentlige immunologiske funktioner, både under vævshomeostase og i forskellige patologiske tilstande. Immunceller hjemmehørende i normal hud menes at gennemføre immunosurveillance 3 og er blevet vist at spille en rolle i udviklingen af inflammatoriske lidelser, såsom psoriasis 4. I psoriatisk læsionale hud, både CD4 + og CD8 + T-celler infiltreret var observed og det blev vist, at forholdet mellem CD4 og CD8 varierer afhængigt af sygdomsstatus 5. Men disse populationer af celler er vanskelige at undersøge, fordi eksisterende teknikker tillader isolering af kun få celler.
De for tiden udbredte teknikker til T-celle-isolation fra menneskehud kombinere mekanisk hud dissociation med enzymatisk behandling. Human hud biopsier er udførligt hakket og inkuberet med enzymer såsom trypsin, collagenase og / eller EDTA 6-8. I betragtning af at huden er en barriere væv, som er meget modstandsdygtigt over for trækkræfter og mekanisk opdeling, de etablerede fremgangsmåder til T-celle-isolation produceret meget få celler, og endda lavere antal af levedygtige celler, hvilket gør ex vivo celledyrkning af disse cellepopulationer vanskelig og udfordrende.
Her rapporterer vi en modificeret metode til at isolere lymfocytter fra både sundt og involverede psoriasis menneskelig hud ved at kombinere mechanical dissociation af huden ved hjælp af en automatiseret væv dissociator stedet for den etablerede metode ekstensivt hakning, sammen med enzymatisk fordøjelse ved hjælp af collagenase. Forskellige levedygtige immuncelleundergrupper herunder DC'er og T-celler blev observeret efter fremstilling af en enkelt-cellesuspension. Vigtigere ekspressionen af overflademarkører CD3, CD4 og CD8 blev godt bevaret. Således fremstillede celler, er klar til brug i ex vivo cellekulturer eller flowcytometrisk analyse. Denne protokol er blevet anvendt med held til analyse af enkelte hudbiopsier (4 mm) afledt fra læsionale hud med psoriasis. Resultaterne viste, at huden resident patient T-celler produceret mere inflammatoriske cytokiner såsom IL-17 og IFNy sammenlignet med raske frivillige 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi en protokol til effektivt at isolere huden hjemmehørende T-celler fra humane hud biopsier. Fordelen ved denne protokol er isoleringen af relativt høje antal levedygtige lymfocytter og udtrykker relevante overflademarkører. Celleundergrupperne identificerede var: CD11c + DC'er, CD4 + og CD8 + T-celler og Foxp3 + CD25 + celler. Vigtigere, ex vivo kultur af isolerede hud residente T-celler var meget godt gennemførlig og tillad…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hud biopsier fra psoriasispatienter blev venligst stillet til rådighed af Dr. Andreas Koerber (Dermatology afdeling på University of Essen, Tyskland) efter oral eller skriftligt informeret samtykke til videnskabelig brug.
XH understøttes også af NSFC 61263039 og NSFC 11.101.321.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
Referências
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
