Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en<em> Ex Vivo</em> Cell Culture
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
Menselijke huid een belangrijke barrière functie en bevat diverse immuuncellen die bijdragen aan weefsel homeostase en bescherming tegen pathogenen. Aangezien de huid is relatief gemakkelijk te bereiken, biedt een ideaal platform perifere immuun regulerende mechanismen te bestuderen. Immune resident cellen in gezonde huid gedrag immunosurveillance, maar spelen ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van inflammatoire huidaandoeningen, zoals psoriasis. Ondanks nieuwe inzichten, is ons begrip van de biologie onderliggende verschillende inflammatoire huidaandoeningen nog beperkt. Er is behoefte aan goede kwaliteit (interne) celpopulaties geïsoleerd uit biopsie huidmonsters. Tot dusver isolatieprocedures zijn ernstig gehinderd door het ontbreken van het verkrijgen van een voldoende aantal levensvatbare cellen. Isolatie en daaropvolgende analyse zijn ook beïnvloed door het verlies van immune cellijn markers, vanwege de mechanische en chemische stress veroorzaakt door de huidige dissociatie procedures ter verkrijgingenkele celsuspensie. Hier beschrijven we een gemodificeerde methode om T-cellen van zowel gezonde en betrokken psoriatische menselijke huid isoleren combineren mechanische dissociatie huid behulp van een geautomatiseerde weefsel dissociator en collagenase behandeling. Deze methode behoudt expressie van de meeste immune lineage markers zoals CD4, CD8, CD 11 c Foxp3 en op de bereiding van enkelvoudige celsuspensies. Voorbeelden van succesvolle CD4 + T cel isolatie en vervolgens fenotypische en functionele analyse getoond.
Introduction
De huid, als de primaire interface tussen het lichaam en het milieu, biedt de eerste verdedigingslinie tegen externe fysische, chemische en biologische beledigingen zoals verwonding, ultraviolette straling en micro-organismen. Huid bestaat uit twee grote compartimenten, de epidermis en de dermis, en bevat een verscheidenheid van immuuncellen zoals Langerhans cellen, macrofagen, dendritische cellen (DC's), en ongeveer 20 miljard memory T-cellen bijna tweemaal zoveel in de totale bloedvolume 1 , 2. Een groeiende hoeveelheid gegevens ondersteunen het idee dat de huid essentiële immunologische functies, zowel tijdens weefsel homeostase en in verschillende pathologische aandoeningen. Immuuncellen in normale huid verblijfplaats wordt gedacht dat immunosurveillance 3 voeren en hebben aangetoond dat het een rol in de ontwikkeling van ontstekingsaandoeningen zoals psoriasis 4 spelen. In psoriatische letselhuid, zowel CD4 + als CD8 + T cellen geïnfiltreerd observed en werd aangetoond dat de verhouding van de CD4 en CD8 varieert afhankelijk van de ziektestatus 5. Echter, deze celpopulaties zijn moeilijk te bestuderen omdat de bestaande technieken maken het isoleren van slechts enkele cellen.
De momenteel op grote schaal gebruikt technieken voor het T-cel isolatie van de menselijke huid te combineren mechanische huid dissociatie met enzymatische behandeling. De menselijke huid biopten worden uitgebreid gehakt en geïncubeerd met enzymen zoals trypsine, collagenase en / of EDTA 6-8. Aangezien de huid een barrière weefsel dat zeer resistent is tegen trekkrachten en mechanische disaggregatie de gevestigde werkwijzen van T cel isolatie geproduceerd zeer weinig cellen, en zelfs lagere aantallen van levensvatbare cellen, die ex vivo celkweek maakt van deze celpopulaties moeilijk en uitdagend.
Hier melden wij een aangepaste methode om lymfocyten van zowel gezonde en betrokken psoriatische menselijke huid te isoleren door het combineren van mechansche dissociatie van de huid met behulp van een geautomatiseerde weefsel dissociator plaats van de gevestigde werkwijze van extensief hakken, met behulp van enzymatische digestie collagenase. Verschillende levensvatbare immuuncelsubklassen zoals DC en T-cellen werden na de bereiding van een enkele-celsuspensie. Vooral de expressie van de oppervlaktemarkers CD3, CD4 en CD8 was goed geconserveerd. Aldus bereide cellen, klaar voor gebruik in ex vivo celkweken of flowcytometrische analyse. Dit protocol is met succes toegepast voor de analyse van afzonderlijke huidbiopsies (4 mm) afkomstig van letselhuid van psoriasis. De resultaten toonden aan dat de huid inwoner patiënt T-cellen geproduceerd meer inflammatoire cytokines, zoals IL-17 en IFNy in vergelijking met gezonde vrijwilligers 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een protocol om de huid aanwezige T-cellen uit menselijke huid biopten efficiënt isoleren. Het voordeel van dit protocol is de isolatie van relatief grote aantallen levensvatbare lymfocyten en expressie relevant oppervlaktemerkers. De cel subsets geïdentificeerd waren: CD 11 c + DCs, CD4 + en CD8 + T-cellen en CD25 + Foxp3 + cellen. Belangrijk is dat ex vivo cultuur van geïsoleerde huid resident T-cellen was zeer goed haalbaar en liet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Huid biopten van psoriasis patiënten werden vriendelijk verschaft door Dr. Andreas Koerber (afdeling Dermatologie aan de Universiteit van Essen, Duitsland) na mondeling dan wel schriftelijk toestemming voor wetenschappelijk gebruik.
XH wordt ook ondersteund door NSFC 61263039 en NSFC 11.101.321.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
Referências
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
