Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em> Ex Vivo</em> Zellkultur
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
Die menschliche Haut hat eine wichtige Barrierefunktion und enthält verschiedene Immunzellen, die zu Gewebshomöostase und Schutz vor Krankheitserregern beitragen. Da die Haut für den Zugriff relativ einfach ist, bietet es eine ideale Plattform peripheren Immunregulationsmechanismen zu untersuchen. Immun-residenten Zellen in gesunde Haut Verhalten immunosurveillance, sondern spielen auch eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Hauterkrankungen wie Psoriasis. Trotz Schwellen Einsichten, unser Verständnis der Biologie verschiedenen entzündlichen Hauterkrankungen zugrunde liegen noch begrenzt. Es besteht ein Bedarf für eine gute Qualität (single) Zellpopulationen aus biopsiert Hautproben isoliert. Bisher Isolierungsverfahren wurden durch einen Mangel an Erhalten einer ausreichenden Anzahl von lebensfähigen Zellen ernsthaft behindert. Isolierung und die anschließende Analyse wurden auch durch den Verlust der Immunzelllinie Marker, aufgrund der mechanischen und chemischen Beanspruchung durch die aktuellen Dissoziation Verfahren betroffen zu erhaltenEinzelzellsuspension. Hier beschreiben wir eine modifizierte Methode von T-Zellen zu isolieren, sowohl gesunde und engagierte psoriatischer menschliche Haut durch mechanische Haut Dissoziation Kombination eines automatisierten Gewebe Dissociator und Kollagenase Behandlung. Diese Methodik bewahrt Expression der meisten Immun Linie Marker wie CD4, CD8, Foxp3 und CD11c auf die Herstellung von Einzelzellsuspensionen. Beispiele für erfolgreiche CD4 + T – Zell – Isolierung und anschließende phänotypische und funktionelle Analyse gezeigt.
Introduction
Die Haut, als primäre Schnittstelle zwischen dem Körper und der Umgebung, bietet die erste Verteidigungslinie gegen äußere physikalische, chemische und biologische Beleidigungen wie Verwundung, UV-Strahlung und Mikroorganismen. Haut besteht aus zwei Hauptfächer, die Epidermis und die Dermis, und enthält eine Vielzahl von Immunzellen einschließlich Langerhans'schen Zellen, Makrophagen, dendritischen Zellen (DCs) und etwa 20 Milliarden Gedächtnis – T – Zellen, fast doppelt so viele , die in der gesamten Blutvolumen 1 , 2. Eine wachsende Zahl von Daten unterstützt die Vorstellung, dass die Haut wesentliche immunologische Funktionen, sowohl während der Gewebehomöostase und in verschiedenen pathologischen Zuständen. Immunzellen mit Wohnsitz in normaler Haut sind gedacht immunosurveillance 3 zu leiten und haben eine Rolle bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen wie Psoriasis 4 zu spielen gezeigt. In psoriatischer läsionaler Haut, sowohl CD4 + und CD8 + T – Zellen infiltriert waren observed und es wurde gezeigt , dass das Verhältnis der CD4 und CD8 5 auf der Krankheitszustand variiert. Jedoch sind diese Populationen von Zellen schwierig zu studieren, weil bestehende Techniken, um die Isolierung von nur wenigen Zellen ermöglichen.
Die derzeit weit verbreiteten Techniken zur T-Zell-Isolierung aus der menschlichen Haut verbinden mechanische Haut Dissoziation mit enzymatische Behandlung. Menschliche Hautbiopsien werden in großem Umfang zerkleinert und inkubiert mit Enzymen wie Trypsin, Kollagenase und / oder EDTA 6-8. Bedenkt man, dass die Haut eine Barrieregewebe ist, die Zugkräfte und mechanische Disaggregation sehr widerstandsfähig ist, die etablierten Methoden der T Zellisolierung sehr wenige Zellen produziert und noch geringere Anzahl von lebensfähigen Zellen, die ex vivo Zellkultur dieser Zellpopulationen schwierig macht , und herausfordernd.
Hier berichten wir über eine modifizierte Methode zur Isolierung von Lymphozyten aus gesunden und beteiligt psoriatischer menschliche Haut durch mechan Kombinationsche Dissoziation der Haut eines automatisierten Gewebe Dissociator anstatt die etablierte Methode ausgiebig zerkleinern, zusammen mit enzymatische Verdauung mit Kollagenase verwenden. Verschiedene lebensfähige Immunzelluntergruppen einschließlich DCs und T-Zellen wurden nach der Herstellung einer Einzelzellsuspension beobachtet. Wichtig wurde die Expression der Oberflächenmarker CD3, CD4 und CD8 gut erhalten. So hergestellten Zellen, sind bereit für den Einsatz in Ex – vivo – Zellkulturen oder Durchflusszytometrie – Analyse. Dieses Protokoll wurde für die Analyse der einzelnen Hautbiopsien (4 mm), abgeleitet von fallener Haut von Psoriasis-Patienten erfolgreich eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten , dass residente Haut Patienten T – Zellen mehr inflammatorische Zytokine wie IL-17 produziert und IFNy im Vergleich zu gesunden Probanden 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir ein Protokoll zur effizienten Haut resident T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien isolieren. Der Vorteil dieses Protokolls ist die Isolierung von relativ hohen Anzahl lebensfähiger Lymphozyten und relevante Oberflächenmarker exprimieren. Die Zell – Untergruppen identifiziert wurden , waren: CD11c + DCs, CD4 + und CD8 + T – Zellen und Foxp3 + CD25 + Zellen. Wichtig ist , dass Ex – vivo – Kultur der isolierten Haut resident …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hautbiopsien von Patienten mit Psoriasis wurden freundlicherweise von Dr. Andreas Koerber (Dermatologie-Abteilung an der Universität Essen, Deutschland) nach mündlicher oder schriftlicher Einverständniserklärung für wissenschaftliche Zwecke zur Verfügung gestellt.
XH wird auch durch NSFC 61263039 und 11101321 NSFC unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
Referências
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
