Descrevemos um protocolo para isolar eficientemente as células T residentes na pele de biópsias de pele humana. Este protocolo produz um número suficiente de linfócitos viáveis residentes na pele humana para análise de citometria de fluxo e cultura ex vivo.
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Artigo de método
Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e
Neste artigo
Resumo
Resumo
A pele humana tem uma função de barreira importante e contém várias células imunitárias que contribuem para a homeostase dos tecidos e protecção contra agentes patogénicos. Como a pele é relativamente fácil de acesso, ele fornece uma plataforma ideal para estudar mecanismos de regulação do sistema imunológico periféricos. células residentes na conduta imunes pele saudável imunovigilância, mas também desempenhar um papel importante no desenvolvimento de doenças de pele inflamatórias, tais como a psoríase. Apesar percepções emergentes, a nossa compreensão da biologia subjacente várias doenças de pele inflamatória é ainda limitada. Há uma necessidade de populações de células (single) de boa qualidade isoladas de amostras de pele biopsiados. Até agora, os procedimentos de isolamento ter sido seriamente dificultados pela falta de obtenção de um número suficiente de células viáveis. Isolamento e análise posterior também foram afetados pela perda de marcadores de linhagem de células do sistema imunológico, devido ao estresse mecânico e químico causado pelos procedimentos de dissociação atuais para obtersuspensão de células individuais. Aqui, descrevemos um método modificado para isolar as células T a partir de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação de dissociação da pele mecânica usando um Dissociator de tecido automático e tratamento de colagenase. Esta metodologia preserva expressão da maior parte dos marcadores de linhagem imunes, tais como CD4, CD8, CD11c e Foxp3 mediante a preparação de suspensões de células únicas. Os exemplos de sucesso de isolamento de células T CD4 + e fenotípica subsequente e análise funcional são mostrados.
Introdução
A pele, como a interface primária entre o corpo e o ambiente, proporciona a primeira linha de defesa contra físico externo, insultos químicos e biológicos, tais como ferimentos, radiação ultravioleta e micro-organismos. Pele compreende dois compartimentos principais, a epiderme e a derme, e contém uma variedade de células imunitárias, incluindo células de Langerhans, macrófagos, células dendríticas (DC), e cerca de 20 mil milhões de células T de memória, quase o dobro do número presente em todo o volume de sangue 1 , 2. Um crescente corpo de dados suporta a noção de que a pele tem funções imunológicas essenciais, tanto durante a homeostase do tecido e em v....
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Protocolo
NOTA: As biópsias de pele de indivíduos saudáveis foram obtidos a partir de restos de pele abdominal dos indivíduos submetidos a cirurgia plástica eletiva, após consentimento informado oral ou escrita para uso científico. O uso de pele humana foi aprovado e em conformidade com os regulamentos estabelecidos pelos médicos Comitês de Ética em Pesquisa com Seres Humanos centro médico da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda e Universidade de Essen, Alemanha.
1. Preparação de suspensões de células individuais de Pele Humana (Trabalho estéril em um Fluxo de-gabinete se Cultura de Células posterior é necessária)
- Prepare meio de cu....
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Resultados
O protocolo apresentado aqui vai render entre 2.200 ± 615 (média ± SEM, pele de voluntários saudáveis) até 178.000 ± 760 (média ± SEM, pele lesionada de pacientes com psoríase) linfócitos viáveis de pele humana quando se utiliza uma única biópsia de pele de 4 mm.
Foram identificados diferentes tipos de CD45 + células em suspensões unicelulares derivadas da pele de indivíduos saudáveis, incluindo as células T CD4 + (~ 45%), as células T CD8 + (~ 30%) e CD11c.......
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Discussão
Aqui, apresentamos um protocolo para isolar eficientemente células T residentes pele de biópsias de pele humana. A vantagem deste protocolo é o isolamento de um número relativamente elevado de linfócitos viáveis, e expressando marcadores de superfície relevante. As subpopulações de células identificadas foram: células CD11c + DCs, CD4 + e CD8 + T e Foxp3 + CD25 +. Importante, a cultura ex vivo de células T da pele isolado residentes foi muito bem possível e.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
biópsias de pele de pacientes com psoríase foram gentilmente cedidas pelo Dr. Andreas Koerber (departamento de Dermatologia da Universidade de Essen, Alemanha), após consentimento informado oral ou escrita para uso científico.
XH também é suportado pelo NSFC 61263039 e 11101321 NSFC.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Punção de biópsia descartável | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Bisturis estéreis descartáveis | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS Tubo C | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Tampa azul, usado como tubo de dissociação. |
| gentleMACS Dissociador | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Dissociador de tecido automatizado. Usando o "programa spleen_01" para dissociação da biópsia de pele. |
| Filtro de células | BD | 352350 | 70 µ m nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Piruvato de sódio | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Life Technologies | 15140-122 | |
| Humano Soro agrupado (HPS) | preparado | ||
| Colagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Tipo 1-A, adequado para cultura de células |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Corante de viabilidade fixável (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Corar as células mortas antes da fixação celular; diluir com PBS a 1:1.000 |
| Concentrado de Fixação/Permeabilização | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Diluente de Fixação/Permeabilização | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Tampão de Permeabilização (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Clone de 563879 BD CD45 anti-humano de camundongo | : HI30; fator de diluição 1:50 | ||
| FITC Mouse anti-humano CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; fator de diluição 1:50 |
| PE Mouse anti-humano CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; fator de diluição 1:50 |
| ECD Mouse anti-humano CD3 | Beckman - Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; fator de diluição 1:50 para coloração superficial; fator de diluição 1:25 para coloração intracelular. |
| PC5.5 Camundongo anti-humano CD4 | Beckman - Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; fator de diluição 1:200 |
| PeCy7 Camundongo anti-humano CD11c | Beckman - Coulter | A80249 | Clone: BU15; fator de diluição 1:50 |
| APC Camundongo anti-humano CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; fator de diluição 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Rato anti-humano CD8 | Beckman - Coulter | A66332 | Clone: B9.11; fator de diluição 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Camundongo anti-humano CD19 | Beckman - Coulter | A94681 | Clone: J3-119; fator de diluição 1:50 |
| PeCy7 Camundongo anti-humano CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; fator de diluição 1:50 |
| PE Rato anti-humano CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; fator de diluição 1: |
| eFluo450 Rato anti-humano Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; coloração intracelular; fator de diluição 1:50 |
| AlexFluo488 Camundongo anti-humano IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; coloração intracelular; fator de diluição 1:50 |
| PeCy7 Camundongo anti-humano IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S. B3; coloração intracelular; fator de diluição 1:400 |
| Fluorosferas de contagem de fluxo | Beckman - Coulter | 7547053 | Contas de contagem, para citometria de fluxo |
Referências
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains ....
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Reimpressões e permissões
