Linfociti Isolamento da Pelle umana per l'analisi fenotipica e<em> Ex Vivo</em> Cell Culture
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
La pelle umana ha una importante funzione di barriera e contiene varie cellule del sistema immunitario che contribuiscono a omeostasi tissutale e la protezione da agenti patogeni. Come la pelle è relativamente facile da accesso, fornisce una piattaforma ideale per lo studio periferici meccanismi di regolazione del sistema immunitario. cellule residenti immunitario in buona salute immunosorveglianza condotta della pelle, ma anche svolgere un ruolo importante nello sviluppo di malattie infiammatorie della pelle, come la psoriasi. Nonostante intuizioni emergenti, la nostra comprensione della biologia di base varie malattie infiammatorie della pelle è ancora limitata. Vi è una necessità di una buona qualità popolazioni (singolo) di cellule isolate da campioni di pelle biopsiati. Finora, procedure di isolamento sono stati gravemente ostacolati dalla mancanza di ottenere un numero sufficiente di cellule vitali. Isolamento e successiva analisi sono stati colpiti dalla perdita di marcatori lignaggio cellule immunitarie, a causa dello stress meccanico e chimico causato dalle procedure di dissociazione correnti averesospensione singola cella. Qui, descriviamo un metodo modificato per isolare le cellule T sia da salutare e coinvolto pelle umana psoriasica combinando dissociazione pelle meccanico utilizzando un dissociatore tessuto automatizzato e il trattamento collagenasi. Questa metodologia conserva espressione della maggior parte dei marcatori lignaggio immunitario come CD4, CD8, Foxp3 e CD11c sulla preparazione di sospensioni di cellule singole. Sono mostrati esempi di isolamento successo + T CD4 cellule e successiva analisi fenotipica e funzionale.
Introduction
La pelle, come l'interfaccia principale tra il corpo e l'ambiente, fornisce la prima linea di difesa contro fisica esterna, chimiche e insulti biologici quali ferite, radiazioni ultraviolette e microrganismi. Pelle è composto da due vani principali, l'epidermide e il derma, e contiene una varietà di cellule del sistema immunitario, tra cui le cellule di Langerhans, macrofagi, cellule dendritiche (DC), e circa 20 miliardi di cellule T di memoria, quasi il doppio del numero di presenti in tutto il volume di sangue 1 , 2. Un numero sempre crescente di dati supporta l'idea che la pelle ha funzioni immunologiche essenziali, sia durante l'omeostasi dei tessuti e in diverse condizioni patologiche. Le cellule immunitarie residenti nella cute normale si pensa di condurre immunosorveglianza 3 e hanno dimostrato di giocare un ruolo nello sviluppo di malattie infiammatorie come la psoriasi 4. Nella cute lesionata psoriasica, sia CD4 + e CD8 + infiltrati cellule T erano osserved ed è stato dimostrato che il rapporto tra il CD4 e CD8 varia a seconda dello stato di malattia 5. Tuttavia, queste popolazioni di cellule sono difficili da studiare perché le tecniche esistenti consentono l'isolamento di solo poche cellule.
Le tecniche attualmente largamente utilizzati per l'isolamento delle cellule T da pelle umana combinano dissociazione pelle meccanica con trattamento enzimatico. Biopsie cutanee umane sono ampiamente tritata e incubate con enzimi come tripsina, collagenasi e / o EDTA 6-8. Considerando che la pelle è un tessuto barriera che è altamente resistente alle forze di trazione e disgregazione meccanica, i metodi stabiliti di isolamento delle cellule T prodotte pochissime cellule, e anche i numeri inferiori di cellule vitali, che rende ex vivo di coltura cellulare di queste popolazioni cellulari difficile e stimolante.
Qui, riportiamo un metodo modificato per isolare i linfociti provenienti sia sano e coinvolto pelle umana psoriasica combinando Mechanla dissociazione iCal della pelle utilizzando un dissociatore tessuto automatizzato invece del metodo stabilito di ampiamente tritare, insieme a digestione enzimatica con collagenasi. sono stati osservati vari sottoinsiemi di cellule immunitarie vitali tra DC e cellule T dopo la preparazione di una cella singola sospensione. È importante sottolineare che l'espressione dei marcatori di superficie CD3, CD4 e CD8 è stato ben conservato. Le cellule così preparate, sono pronte per l'uso in colture cellulari ex vivo o analisi di citometria di flusso. Questo protocollo è stato impiegato con successo per l'analisi di biopsie cutanee singoli (4 mm) derivati dalla cute lesionale di pazienti affetti da psoriasi. I risultati hanno mostrato che le cellule T dei pazienti della pelle residente prodotte citochine infiammatorie come più IL-17 e IFNγ rispetto ai volontari sani 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare in modo efficace le cellule T della pelle residenti da biopsie cutanee umane. Il vantaggio di questo protocollo è l'isolamento del numero relativamente elevato di linfociti vitali, ed esprimendo marcatori di superficie rilevanti. I sottoinsiemi di cellule identificate sono state: le cellule, CD11c + DCs CD4 + e cellule T CD8 + e Foxp3 + CD25 +. È importante sottolineare che, ex vivo coltura di cellule T de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
biopsie cutanee da pazienti affetti da psoriasi sono stati gentilmente forniti dal Dr. Andreas Koerber (dipartimento di Dermatologia presso l'Università di Essen, Germania) dopo il consenso orale o scritta informato per uso scientifico.
XH è anche supportato da NSFC 61.263.039 e 11.101.321 NSFC.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
Referências
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