표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em> 전의 VIVO</em> 세포 배양
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
인간의 피부는 중요한 장벽 기능을 가지고 있으며, 병원균에서 조직의 항상성 및 보호에 기여하는 다양한 면역 세포가 포함되어 있습니다. 피부 액세스 비교적 용이하기 때문에, 이는 주변 면역 조절 메카니즘을 연구하기위한 이상적인 플랫폼을 제공한다. 면역 상주 건강한 피부 실시 immunosurveillance 세포 있지만는 건선과 같은 염증성 피부 질환의 발달에서 중요한 역할을한다. 새로운 통찰력에도 불구하고, 다양한 염증성 피부 질환의 기초가되는 생물학에 대한 우리의 이해는 여전히 제한된다. 피부 생검 샘플로부터 분리 된 양질의 (하나의) 세포 집단이 필요하다. 지금까지 분리 절차 심각한 생존 세포의 충분한 수를 얻기의 부족에 의해 방해되어왔다. 분리 및 후속 분석 인해 수득 현재 분리 절차에 의해 야기되는 기계적 및 화학적 스트레스, 면역 세포 계통 마커의 손실에 의해 영향을받은단일 세포 현탁액. 여기서는 자동 조직 dissociator 및 콜라게나 제 처리를 사용하여 기계적 피부 분리를 조합하여 건강 관련 건선 모두 인간 피부 T 세포를 분리하는 개질 방법을 설명한다. 이 방법은 단일 세포 현탁액의 준비 시점에 CD4, CD8, Foxp3의와의 CD11c 대부분의 면역 계통 마커의 발현을 유지합니다. 성공적인 CD4 + T 세포의 분리 및 후속 표현형 및 기능 분석의 예는 도시된다.
Introduction
피부는 몸과 환경 사이의 기본 인터페이스로, 외부의 물리적, 화학적 및 상처, 자외선 및 미생물 등의 생물 모욕에 대한 방어의 첫 번째 라인을 제공합니다. 피부는 두 개의 주요 구획, 표피 및 진피를 포함하고, 랑게르한스 세포, 대 식세포, 수지상 세포, 및 약 200 억 메모리 T 세포를 포함하여 면역 세포의 다양한 전체 혈액량 한 거의 두 배가 존재를 포함 2. 증가하는 데이터 기관은 피부 조직의 항상성 동안 다양한 병리 적 상태 모두에서 중요한 면역 기능이 개념을 지원한다. 정상 피부에 상주 면역 세포 immunosurveillance 3을 수행하는 것으로 생각되고, 이러한 4 건선 같은 염증성 질환의 발달에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 건선 병변 피부에서 CD4 +와 CD8 + 모두 T 세포가 OBS했다 침투erved하고는 CD4 및 CD8의 비율은 질병 상태 (5)에 따라 다르다는 것을 나타내었다. 그러나, 이러한 세포의 집단은 기존의 기술은 단지 소수의 세포를 분리 할 수 있기 때문에 연구하기가 어렵다.
인간 피부 T 세포의 분리를위한 현재 널리 사용되는 기술은 효소 처리로 기계적 피부 분리를 결합한다. 인간의 피부 조직 검사는 광범위하게 다진 및 트립신, 콜라게나 제 및 / 또는 EDTA 6-8와 같은 효소와 함께 배양한다. 피부 인장력 기계적 세분화에 매우 내성이 배리어 티슈 인 것을 고려하면, T 세포의 분리의 설정 방법은이 세포 집단 어렵고 생체 외 세포 배양한다 거의 세포 및 생존 세포의 더 낮은 수를 생산 도전적인.
여기, 우리는 mechan을 결합하여 건강하고 참여 모두 건선 인간의 피부에서 림프구를 분리하는 수정 방법을보고효소 소화 콜라 사용과 함께, 자동화 조직 dissociator 닦지 않고 광범위의 기존 방법을 사용하여 피부의 iCal 해리. 수지상 세포 및 T 세포를 포함하는 다양한 면역 세포 생존 서브 세트는 단일 세포 현탁액을 제조 한 후 관찰되었다. 중요한 것은 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8의 발현이 잘 보존되었다. 이와 같이 제조 된 세포를 생체 외 세포 배양 또는 유세포 분석에 사용하기위한 준비가되어있다. 이 프로토콜은 성공적 건선 환자의 피부 병변에서 유래 된 단일 피부 생검 (4 ㎜)의 분석을 위해 사용되어왔다. 결과는 피부 거주 환자의 T 세포가 건강한 지원자 9 비교하여 IL-17, IFNγ와 같은 더 많은 염증성 사이토 카인을 생산 것으로 나타났다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서는 효율적으로 인간의 피부 생검으로부터 피부 상주 T 세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 장점은 가능한 림프구의 상대적으로 높은 수의 분리이고, 관련 표면 마커를 발현. 식별 된 셀의 서브 세트가 있었다 :하는 CD11c + 수지상 세포, CD4 + 및 CD8 + T 세포와 Foxp3의 + CD25 + 세포를 포함한다. 중요한 것은, 절연 피부 상주 T 세포의 생…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
건선 환자의 피부 조직 검사는 친절 박사 안드레아스 Koerber 과학적인 사용을위한 구두 또는 서면 동의서 후 (에센, 독일의 대학 피부과 부서)에 의해 제공되었다.
XH도 NSFC 61263039과 NSFC 11101321에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
Referências
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