Lymfocyttisolasjonsmetoder fra menneskelig hud for fenotypeanalyser og<em> Ex Vivo</em> Cell Culture
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
Menneskets hud har en viktig barrierefunksjon og inneholder forskjellige immunceller som bidrar til vev homeostase og beskyttelse mot patogener. Når huden er relativt enkelt å få tilgang til, gir det en ideell plattform for å studere perifere immunreguleringsmekanismer. Immunhørende celler i frisk hud oppførsel immunosurveillance, men også spille en viktig rolle i utviklingen av inflammatoriske hudsykdommer, slik som psoriasis. Til tross for nye innsikter, er vår forståelse av biologi underliggende ulike inflammatoriske hudsykdommer fortsatt begrenset. Det er behov for god kvalitet (single) celle populasjoner isolert fra vevsprøve hudprøver. Så langt har isoleringsprosedyrer blitt alvorlig hemmet av mangel på å skaffe et tilstrekkelig antall levedyktige celler. Isolasjon og påfølgende analyse har også blitt påvirket av tap av immunceller avstamning markører, på grunn av mekanisk og kjemisk stress forårsaket av dagens dissosiasjon handlinger for å innhenteenkel cellesuspensjon. Her beskriver vi en modifisert metode for å isolere T-celler fra både sunn og involvert psoriasis menneskelig hud ved å kombinere mekanisk hud dissosiasjon ved hjelp av en automatisert vev dissociator og collagenase behandling. Denne metodikken bevarer uttrykk for de fleste immun avstamning markører som CD4, CD8, foxp3 og CD11c på utarbeidelse av enkeltcellesuspensjoner. Eksempler på vellykket CD4 + T-celler isolert og påfølgende fenotypiske og funksjonelle analyser er vist.
Introduction
Huden, som den primære grensesnittet mellom kroppen og miljøet, gir den første linjen i forsvaret mot ytre fysiske, kjemiske og biologiske fornærmelser som såret, ultrafiolett stråling og mikroorganismer. Hud består av to hovedrom, epidermis og dermis, og inneholder en rekke forskjellige immunceller, inkludert Langerhans-celler, makrofager, dendrittiske celler (DCS), og omtrent 20 milliarder minne-T-celler, nesten dobbelt så mange tilstede i hele blodvolumet 1 , 2. En voksende mengde data støtter forestillingen om at huden har viktige immunologiske funksjoner, både under vev homeostase og i ulike patologiske tilstander. Immunceller bosatt i normal hud er antatt å gjennomføre immunosurveillance 3 og har blitt vist å spille en rolle i utviklingen av inflammatoriske sykdommer slik som psoriasis 4. I psoriasis angrepne hud, både CD4 + og CD8 + infiltrert T-celler var observed og det ble vist at forholdet mellom CD4 og CD8 varierer avhengig av sykdomsstatus 5. Men disse populasjoner av celler som er vanskelige å studere fordi eksisterende teknikker tillater isolering av bare noen få celler.
Den tiden brukte teknikker for T-celle isolert fra menneskelig hud kombinerer mekanisk hud dissosiasjon med enzymatisk behandling. Menneskelig hud biopsier er i utstrakt hakket og inkuberes med enzymer som trypsin, collagenase og / eller EDTA 6-8. Tatt i betraktning at huden er en barriere vev som er meget motstandsdyktig mot strekkrefter og mekanisk dekomponering, de etablerte fremgangsmåter for T-celle-isolasjon produsert svært få celler, og til og med lavere antall levedyktige celler, noe som gjør ex vivo cellekultur av disse cellepopulasjoner vanskelig og utfordrende.
Her rapporterer vi en modifisert metode for å isolere lymfocytter fra både sunn og involvert psoriasis menneskelig hud ved å kombinere mechanical dissosiasjon av huden ved hjelp av en automatisert vev dissociator i stedet for den etablerte fremgangsmåten i stor utstrekning hakking, sammen med enzymatisk fordøyelse ved hjelp av kollagenase. Forskjellige immunlevedyktige celleundergrupper inkludert DC og T-celler ble observert etter fremstilling av en enkeltcellesuspensjon. Viktigere ekspresjonen av de overflatemarkører CD3, CD4 og CD8 ble godt bevart. Celler dermed forberedt, er klar til bruk i ex vivo cellekulturer eller flowcytometrisk analyse. Denne protokollen har blitt benyttet for analyse av enkelt hud biopsier (4 mm) avledet fra angrepne hud av psoriasispasienter. Resultatene viste at huden bosatt pasient T-celler produsert mer inflammatoriske cytokiner som IL-17 og IFNy i forhold til friske frivillige 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi en protokoll for å effektivt isolere huden bosatt T-celler fra menneskelig hud biopsier. Fordelen med denne protokollen er isolasjon av relativt høye antall av levedyktige lymfocytter, og som uttrykker relevante overflatemarkører. Cellen undergrupper identifisert var: CD11c + dansk sokkel, CD4 + og CD8 + T-celler og foxp3 + CD25 + celler. Viktigere, ex vivo kultur isolert hud bosatt T-celler var veldig godt mulig og lov for påfølgend…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Skin biopsier fra psoriasispasienter ble vennlig levert av Dr. Andreas Koerber (Dermatology avdeling ved Universitetet i Essen, Tyskland) etter muntlig eller skriftlig informert samtykke for vitenskapelig bruk.
XH støttes også av NSFC 61263039 og NSFC 11101321.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
Referências
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
