Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em> Ex Vivo</em> Cultura de Células

Summary

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Abstract

A pele humana tem uma função de barreira importante e contém várias células imunitárias que contribuem para a homeostase dos tecidos e protecção contra agentes patogénicos. Como a pele é relativamente fácil de acesso, ele fornece uma plataforma ideal para estudar mecanismos de regulação do sistema imunológico periféricos. células residentes na conduta imunes pele saudável imunovigilância, mas também desempenhar um papel importante no desenvolvimento de doenças de pele inflamatórias, tais como a psoríase. Apesar percepções emergentes, a nossa compreensão da biologia subjacente várias doenças de pele inflamatória é ainda limitada. Há uma necessidade de populações de células (single) de boa qualidade isoladas de amostras de pele biopsiados. Até agora, os procedimentos de isolamento ter sido seriamente dificultados pela falta de obtenção de um número suficiente de células viáveis. Isolamento e análise posterior também foram afetados pela perda de marcadores de linhagem de células do sistema imunológico, devido ao estresse mecânico e químico causado pelos procedimentos de dissociação atuais para obtersuspensão de células individuais. Aqui, descrevemos um método modificado para isolar as células T a partir de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação de dissociação da pele mecânica usando um Dissociator de tecido automático e tratamento de colagenase. Esta metodologia preserva expressão da maior parte dos marcadores de linhagem imunes, tais como CD4, CD8, CD11c e Foxp3 mediante a preparação de suspensões de células únicas. Os exemplos de sucesso de isolamento de células T CD4 ⁺ e fenotípica subsequente e análise funcional são mostrados.

Introduction

A pele, como a interface primária entre o corpo e o ambiente, proporciona a primeira linha de defesa contra físico externo, insultos químicos e biológicos, tais como ferimentos, radiação ultravioleta e micro-organismos. Pele compreende dois compartimentos principais, a epiderme e a derme, e contém uma variedade de células imunitárias, incluindo células de Langerhans, macrófagos, células dendríticas (DC), e cerca de 20 mil milhões de células T de memória, quase o dobro do número presente em todo o volume de sangue ^{1 , 2.} Um crescente corpo de dados suporta a noção de que a pele tem funções imunológicas essenciais, tanto durante a homeostase do tecido e em várias condições patológicas. Células imunes residentes na pele normal são pensados ​​para conduzir imunovigilância e ³ têm demonstrado desempenhar um papel no desenvolvimento de doenças inflamatórias tais como psoríase ^4. Na pele lesionada psoriática, tanto CD4 ⁺ e CD8 ⁺ foram infiltradas células T observed e foi demonstrado que a razão entre a CD4 e CD8 varia dependendo do estado da doença ^5. No entanto, estas populações de células são difíceis de estudar porque as técnicas existentes permitem o isolamento de apenas algumas células.

As técnicas atualmente utilizados para o isolamento de células T a partir de pele humana combinam dissociação da pele mecânica com tratamento enzimático. As biópsias da pele humana são extensamente triturada e incubada com enzimas como a tripsina, colagenase e / ou EDTA ^6-8. Considerando-se que a pele é um tecido de barreira, que é altamente resistente a forças de tracção e de desagregação mecânica, os métodos estabelecidos de isolamento de células T produzido muito poucas células, e até mesmo menor número de células viáveis, o que torna a cultura ex vivo de células destas populações de células difíceis e desafiador.

Aqui, nós relatamos um método modificado para isolar linfócitos de pele humana psoriática saudável e envolvido pela combinação mechanical dissociação da pele usando um Dissociator tecido automatizada em vez do método estabelecido de picagem extensivamente, em conjunto com a digestão enzimática com colagenase. Vários subconjuntos de células imunitárias, incluindo as DCs viáveis ​​e células T foram observadas após a preparação de uma suspensão de célula única. É importante notar a expressão dos marcadores de superfície CD3, CD4 e CD8 foi bem preservada. As células assim preparadas, estão prontos para uso em culturas de células ex vivo ou análise de citometria de fluxo. Este protocolo tem sido empregue com sucesso para a análise de biópsias de pele individuais (4 mm) derivadas a partir da pele lesionada de pacientes com psoríase. Os resultados mostraram que as células T do paciente de pele residente produzido mais citocinas inflamatórias como a IL-17 e IFN-y, em comparação com voluntários saudáveis ^​​9.

Protocol

NOTA: As biópsias de pele de indivíduos saudáveis ​​foram obtidos a partir de restos de pele abdominal dos indivíduos submetidos a cirurgia plástica eletiva, após consentimento informado oral ou escrita para uso científico. O uso de pele humana foi aprovado e em conformidade com os regulamentos estabelecidos pelos médicos Comitês de Ética em Pesquisa com Seres Humanos centro médico da Universidade Radboud, Nijmegen, Holanda e Universidade de Essen, Alemanha. 1. Preparação de s…

Representative Results

O protocolo apresentado aqui vai render entre 2.200 ± 615 (média ± SEM, pele de voluntários saudáveis) até 178.000 ± 760 (média ± SEM, pele lesionada de pacientes com psoríase) linfócitos viáveis ​​de pele humana quando se utiliza uma única biópsia de pele de 4 mm. Foram identificados diferentes tipos de CD45 + células em suspensões unicelulares derivadas da pele de indivíduos saudáveis, incluindo as células T CD4 + (~ 45%), as células T CD8 <sup…

Discussion

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar eficientemente células T residentes pele de biópsias de pele humana. A vantagem deste protocolo é o isolamento de um número relativamente elevado de linfócitos viáveis, e expressando marcadores de superfície relevante. As subpopulações de células identificadas foram: células CD11c ⁺ DCs, CD4 ⁺ e CD8 ⁺ T e Foxp3 ⁺ CD25 ^+. Importante, a cultura ex vivo de células T da pele isolado residentes foi muito be…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Disposable Biopsy Punch	Kai Europe	BP-40F	4 mm
Disposable sterile scalpels	Dalhausen	1100000510
gentleMACS C tube	Miltenyi Biotech	130-093-237	Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotech	130-093-235	Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer	BD	352350	70 µm nylon
96-well U-bottom plate	Greiner Bio-One	650180
RPMI 1640	Life Technologies	22409-015
Sodium pyruvate	Life Technologies	11360-039
GlutaMAX	Life Technologies	35050-061
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Human Pooled Serum (HPS)	in house prepared
Collagenase I	Sigma-Aldrich	C2674	Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I	Calbiochem	260913
PBS	B Braun	3623140
BSA	Sigma-Aldrich	A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780	eBioscience	65-0865-18	Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000
Fixation/Permeabilization Concentrate	eBioscience	00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent	eBioscience	00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x)	eBioscience	00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45	BD	563879	Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14	Dako	T0844	Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56	Dako	R7127	Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3	Beckman – Coulter	A07748	Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4	Beckman – Coulter	B16491	Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c	Beckman – Coulter	A80249	Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c	Miltenyi Biotech	130-090-903	Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8	Beckman – Coulter	A66332	Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19	Beckman – Coulter	A94681	Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25	eBioscience	AD5-8E7	Clone: BC96; dilution factor 1:50
PE Rat anti-human CLA	Miltenyi Biotech	130-091-635	clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3	eBIoscience	48-4776-42	Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A	eBioscience	53-7179-42	Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg	eBioscience	25-7319-41	Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres	Beckman – Coulter	7547053	Counting beads, for flow cytometry