Lymfocytisolering från human hud för fenotypisk analys och<em> Ex vivo</em> Cell Culture
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
Mänsklig hud har en viktig barriärfunktion och innehåller olika immunceller som bidrar till vävnad homeostas och skydd mot patogener. Eftersom huden är relativt lätt att komma åt, det ger en idealisk plattform för att studera perifera immunregleringsmekanismer. Immunresidensceller i frisk hud uppträdande immunosurveillance, men också spela en viktig roll i utvecklingen av inflammatoriska hudsjukdomar, såsom psoriasis. Trots nya insikter, är vår förståelse av biologin bakom olika inflammatoriska hudsjukdomar fortfarande begränsad. Det finns ett behov av god kvalitet (singel) cellpopulationer isolerade från biopsier hudprover. Hittills har isoleringsprocedurer blivit allvarligt hämmas av en brist på att erhålla ett tillräckligt antal viabla celler. Isolering och efterföljande analys har också påverkats av förlusten av immunceller härstamning markörer, på grund av mekanisk och kemisk stress som orsakas av de nuvarande dissociation förfaranden för att erhållaenkelcellsuspension. Här beskriver vi en modifierad metod för att isolera T-celler från både friska och inblandade psoriatisk människohud genom att kombinera mekanisk hud dissociation användning av en automatiserad vävnads dissociator och kollagenas-behandling. Denna metod bevarar uttryck för de flesta immun härstamning markörer såsom CD4, CD8, Foxp3 och CD11c på framställningen av enstaka cellsuspensioner. Exempel på framgångsrika CD4 + T-cell isolering och efterföljande fenotypiska och funktionell analys visas.
Introduction
Huden, som det primära gränssnittet mellan kroppen och miljön, är den första försvarslinjen mot yttre fysiska, kemiska och biologiska förolämpningar såsom sårskada, ultraviolett strålning och mikroorganismer. Huden innefattar två huvudfack, epidermis och dermis, och innehåller en mängd olika immunceller inkluderande Langerhans celler, makrofager, dendritiska celler (DC), och ca 20 miljarder minnes-T-celler, nästan dubbelt så många som föreligger i hela blodvolymen 1 , 2. En växande mängd data stöder tanken att huden har väsentliga immunologiska funktioner, både under vävnadshomeostas och i olika patologiska tillstånd. Immunceller bosatta i normal hud tros genomföra immunosurveillance 3 och har visat sig spela en roll i utvecklingen av inflammatoriska störningar, såsom psoriasis 4. I psoriatisk lesionell hud, både CD4 + och CD8 + infiltrerade T-celler var observed och det visades att förhållandet mellan CD4 och CD8 varierar beroende på sjukdomsstatus 5. Emellertid dessa populationer av celler är svåra att studera eftersom befintliga tekniker möjliggör isolering av endast få celler.
De för närvarande allmänt använda tekniker för T-cell isolering från mänsklig hud kombinera mekanisk hud dissociation med enzymatisk behandling. Mänsklig hud biopsier omfattande malet och odlades med enzymer som trypsin, kollagenas och / eller EDTA 6-8. Med tanke på att huden är en barriär vävnad som är mycket motståndskraftig mot dragkrafter och mekaniska disaggregation, av etablerade metoder för T-cellisolering produceras mycket få celler, och till och med lägre antalet livskraftiga celler, vilket gör ex vivo cellkultur av dessa cellpopulationer svår och utmanande.
Här rapporterar vi en modifierad metod för att isolera lymfocyter från både friska och engagerade psoriasis mänsklig hud genom att kombinera mechaniCal dissociation av huden med hjälp av en automatiserad vävnads dissociator i stället för den etablerade metoden för omfattande mals tillsammans med enzymatisk spjälkning med hjälp av kollagenas. Olika viabla immuncellundergrupper inklusive DCs och T-celler observerades efter framställning av en enkelcellsuspension. Viktigare uttrycket av de ytmarkörer CD3, CD4 och CD8 var väl bevarad. Celler som sålunda framställts, är klara för användning i ex vivo cellodlingar eller flödescytometrisk analys. Detta protokoll har med framgång använts för analys av enstaka hudbiopsier (4 mm) härrörande från lesionell hud av psoriasispatienter. Resultaten visade att huden bosatt patienten T-celler producerade mer inflammatoriska cytokiner såsom IL-17 och IFN-y i jämförelse med friska försökspersoner 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi ett protokoll för att effektivt isolera huden bosatta T-celler från mänsklig hud biopsier. Fördelen med detta protokoll är isolering av relativt höga antalet livskraftiga lymfocyter, och uttrycka relevanta ytmarkörer. De cellundergrupper identifierades var: CD11c + DCS, CD4 + och CD8 + T-celler och Foxp3 + CD25 + celler. Viktigt, ex vivo odling av isolerade hud bosatta T-celler var mycket väl möjligt och tillåtet för efterföl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hudbiopsier från psoriasispatienter tillhandahölls vänligen av Dr. Andreas Koerber (Dermatology institutionen vid universitetet i Essen, Tyskland) efter muntlig eller skriftlig informerat samtycke för vetenskapliga ändamål.
XH stöds också av NSFC 61263039 och NSFC 11.101.321.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
Referências
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
