Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em> Ex Vivo</em> Hücre Kültürü
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
İnsan derisi önemli bir bariyer işlevi vardır ve patojenlerin doku homeostazında ve korunmasına katkıda çeşitli bağışıklık hücrelerini içerir. Cilt erişimi nispeten kolay olduğundan, periferik immün düzenleyici mekanizmaları incelemek için ideal bir platform sağlar. aynı zamanda bağışıklık yerleşik sağlıklı deri Davranış immüno hücrelerin ancak, sedef hastalığı gibi iltihaplı deri hastalıklarının gelişiminde önemli bir rol oynar. Gelişmekte olan anlayışlar rağmen, çeşitli iltihaplı cilt hastalıkları altında yatan biyolojinin anlayışımız hala sınırlıdır. biyopsi yapılan deri numunelerinden izole kaliteli (tek) hücre popülasyonları için bir ihtiyaç vardır. Şimdiye kadar, izolasyon prosedürleri ciddi canlı hücre yeterli sayıda elde eksikliği ile engellenmiştir edilmiştir. İzolasyon ve sonraki analizler nedeniyle de elde etmek için geçerli ayrılma işlemleri nedeniyle mekanik ve kimyasal strese, immün hücre soyu belirteçleri kaybı etkilenmişTek hücre süspansiyonu. Burada, otomatik bir doku aynştıncı ve kollajenaz muamelesi ile mekanik deri ayrışmasını birleştirerek sağlıklı ve ilgili her iki psoriatik insan deri T hücrelerinin izole edilmesi için bir tadil edilmiş yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması üzerine, CD4, CD8, Foxp3 ve CD11c gibi en bağışıklık soy işaretlerinin ifadesi korur. Başarılı CD4 + T hücre izolasyonu ve sonraki fenotipik ve fonksiyonel analiz örnekleri gösterilmiştir.
Introduction
cilt, vücut ve çevre arasındaki temel arayüz olarak, dış fiziksel, kimyasal ve yaralama, ultraviyole radyasyon ve mikro-organizmalar gibi biyolojik hakaretlerle karşı ilk savunma hattını sağlar. Cilt iki bölme, epidermis ve dermiş içerir ve Langerhans hücreleri, makrofajlar, dendritik hücreler (DC) ve yaklaşık 20 milyar bellek T hücreleri dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri, çeşitli tüm kan hacmi 1 'de yaklaşık iki katı sayıda mevcut içerir 2. Verilerin artan vücut deri doku homeostazında sırasında ve çeşitli patolojik durumlarda, hem temel immünolojik fonksiyonu vardır görüşünü desteklemektedir. Normal deride yerleşik bağışıklık hücreleri immüno 3 yapmak için düşünülen ve sedef 4 gibi iltihaplı bozuklukların gelişiminde bir rol oynadığı gösterilmiştir. Psöriatik lezyonlu deride, CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin hem obs vardı sızmışerved ve CD4 ve CD8 oranı hastalığın durumu 5 bağlı olarak değişir gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücrelerin bu popülasyonlar, mevcut tekniklerin sadece birkaç hücre yalıtılmasını için çalışma zordur.
İnsan derisinden T hücre izolasyonu için şu anda yaygın olarak kullanılan teknikler enzimatik tedavi ile mekanik cilt ayrışmasını birleştirir. İnsan deri biyopsileri yoğun Tripsin, kolajenaz ve / veya EDTA 6-8 gibi enzimler ile inkübe edilir. Cilt germe kuvvetleri ve mekanik ayrıştırma yüksek dirençli bir bariyer doku olduğu göz önüne alındığında, T hücre izolasyon kurulan yöntemleri bu hücre popülasyonlarının zor ve ex vivo hücre kültürü yapar çok az hücre ve canlı hücrelerin daha düşük sayıda üretilen meydan okuma.
Burada, mechan birleştirerek sağlıklı ve ilgili her iki psoriatik insan cildi lenfositlerin izole edilmesi için bir tadil edilmiş yöntem raporenzimatik sindirim kolajenaz ile birlikte otomatik bir doku Dissociator yerine yoğun kıyma kurulan yöntemi kullanarak deri iCal'ın ayrışma. DH'ler ve T hücrelerini içeren çeşitli canlı immün hücre alt tek bir hücre süspansiyonunun hazırlanması sonra görülmüştür. Önemli yüzey markörlerinin CD3, CD4 ve CD8 salgılanma iyi korunmuştur. Bu şekilde hazırlanan hücreler, ex vivo hücre kültürleri veya akış sitometrik analizinde kullanım için hazırdır. Bu protokol başarıyla sedef hastalarının lezyonlu deride türetilmiş tek cilt biyopsisi (4 mm) analizi için istihdam edilmiştir. Sonuçlar cilt ikamet hasta T hücreleri sağlıklı gönüllülere 9 karşılaştırıldığında IL-17 ve IFNy gibi daha inflamatuar sitokinler üretilen gösterdi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, verimli insan derisi biyopsi cilt yerleşik T hücrelerini izole etmek için bir protokol mevcut. Bu protokolün avantajı canlı lenfositlerinin nispeten yüksek sayılar izolasyon ve ilgili yüzey belirteçlerinin ifade. Belirlenen hücre alt edildi: CD11c + DH'ler, CD4 + ve CD8 + T hücreleri ve Foxp3 + CD25 + hücreleri. Önemli olarak, izole edilmiş bir cilt yerleşik T hücrelerinin ex vivo kültür çok iyi uygulanabilir ve daha sonra fo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sedef hastalarının deri biyopsileri nazik Dr. Andreas Koerber bilimsel kullanım için yazılı veya sözlü aydınlatılmış onam sonra (Essen, Almanya Üniversitesi Dermatoloji bölümü) tarafından verilmiştir.
XH da NSFC 61263039 ve NSFC 11101321 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
Referências
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
