Генерация и прививка тканевой инженерии сосудов в мышиной модели
Summary
Здесь мы приводим протокол для создания тканей инженерии трансплантаты сосудов, которые являются функциональными для прививки мышам дважды посева частично индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (PiPSC) – производное клетки гладких мышц и PiPSC – эндотелиальных клеток на decellularized судно лесов биореакторе.
Abstract
The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.
Introduction
Строительство сосудистых трубопроводов является фундаментальной стратегией для хирургического восстановления поврежденных и раненых сосудов в результате сердечно-сосудистых заболеваний. На сегодняшний день, привитые материалы, используемые в хирургии, включают биосовместимые синтетические полимеры (политетрафторэтилен [тефлоновую], вспененного политетрафторэтилена [ПТФЭ; Gore-Tex] или полиэтилентерефталат [дакрона]), аллотрансплантатов, аутологичной ткани перикарда (или подкожной вены) и ксенотрансплантатов 1. Несмотря на то, искусственные трансплантаты (например, Gore-Tex и дакрона) наиболее часто используются такие материалы скорее всего, причиной многочисленных краткосрочных и долгосрочных осложнений, которые включают стеноз, отложение кальция, тромбофлебита эмболизация и инфекций. Хотя пациенты с биологическими трансплантатов присутствующих со снижением тромбоэмболических событий, они по-прежнему сталкиваются ограничения, такие как вторичные отказ трансплантата и укороченной длительности из-за деградации кальцификации 2. Поэтому, несмотря на значительные улучшения в хирургической тechniques на протяжении многих лет, исследователей и клиницистов по-прежнему обременены необходимостью для определения идеального канал для сосудистых заболеваний. Совсем недавно, полевые исследования тканевой инженерии сосудов породило концепцию, в которой клетки были включены в биологически разлагаемых лесов, с целью создания Биомиметические среду, которая олицетворяет собой функциональную емкость для успешной прививки 1. По существу, успех сосудистых конструкций зависит от трех основных компонентов; Клетки, которые составляют каркас, т.е. внутренний слой эндотелиальных клеток и гладкий слой мышечных клеток, каркас, содержащий соответствующий внеклеточный матрикс, чтобы обеспечить механические свойства, сравнимые с нативной сосудистой и молекулярную / клеточной сигнализации, необходимой для инициирования / регулировании ремонт.
Длинные проходимость термин трансплантата и устойчивое развитие нео-тканей в значительной степени зависят от эффективного посева клеток матрикса йereby рендеринга решение типа клеток решающее значение. Несколько докладов продемонстрировать использование зрелых эндотелиальных и гладкомышечных клеток из различных источников для разработки трубопроводов малого диаметра 3-6. Хотя перспективным, отсутствие достаточных аутологичных сосудов для получения зрелых эндотелиальных и гладкомышечных клеток остаются значительным бременем. Совсем недавно, стволовые клетки из различных источников были использована для тканевой инженерии сосудов. Действительно, разнообразие типов стволовых клеток, включая эмбриональные стволовые клетки 7, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) 8,9, PiPSC 10,11, костного мозга, полученные мононуклеары 12, мезенхимальные стволовые клетки 13, эндотелиальные клетки-предшественники и взрослых стенки сосуда -derived антиген стволовой клетки-1 (SCA-1) + стволовых клеток / клеток-предшественников 14,15 все была подтверждена способны дифференцироваться в любой функциональный эндотелиальных или гладкомышечных клеток в ответ на определенных средах иУсловия культивирования. Кроме того, неограниченная емкость самообновления стволовых клеток делает их более кандидатов в отличие от зрелого эндотелиальных и гладкомышечных клеток, которые могут делиться только на конечное число раз, прежде чем подвергнуться аресту роста и старения.
Выбор каркасного материала для создания успешной тканей инженерных судно для прививки зависит от нескольких факторов, таких как биосовместимость, биомеханических свойств и скорости биодеградации. По существу, материалы, используемые для создания каркасов для трансплантатов должны быть биоразлагаемыми и не будет устанавливать ненужные получателей иммунные ответы. Кроме того, он должен включать в себя соответствующую пористость и микроструктуру для прикрепления клеток и последующего выживания. На сегодняшний день, наиболее распространенные материалы, используемые для строительных лесов тканевой инженерии сосудов включают полимеры полигликолевой кислоты, полимолочной кислоты и поли ε-капролактона 16. Совсем недавно, decellularized биологические материалы имеютТакже были применены с некоторым успехом. Несколько лабораторий показали, что посев decellularized человека, собак или свиные сосуды с аутологичных клеток при условии, биологический трансплантат которые сопротивлялись свертывания и гиперплазия интимы 17-19. Другие стратегии в тканевой инженерии сосудов включают белки внеклеточного матрикса на основе сосудистых трансплантатов например, посев клеток в фибрин геля 13 и генерации клеток листы без лесов поддержки 20, 21.
В настоящее время протокол демонстрирует дифференцировку человеческих PiPSC в функциональную эндотелиальных и гладкомышечных клеток, образование биореакторе, состоящей из decellularized помост сосуда питать функциональные производные PiPSC-сосудистых клеток и трансплантации тканей из инженерии сосудов в тяжелой комбинированным иммунодефицитом (SCID ) мышей. PiPSC являются оптимальным тип клеток для использования в тканевой инженерии трансплантатов сосудов, так как эти клетки не образуют опухолей у мышей или повысить этические иалло-иммунные реакции. Кроме того, мы показали, что стратегия для создания Пункты эндотелиальных клеток и Пункты-клеток гладких мышц является эффективным и воспроизводимым 10,11. После этого, мы разработали decellularized сосуд для посева PiPSC, полученных из клеток сосудов тесно имитируют матричные белки, которые существует в родной судна, тем самым повышая прививки и выживания эффективность. Кроме того, decellularization сосудов до посева PiPSC предотвращает возникновение воспалительных реакций, установленных по видам иммунных клеток, таких как макрофаги. Что еще более важно, этот протокол не только представляют собой методологию для создания перспективных сосудистых каналы для перевода на человека, но и дает ценные средства изучения и понимания молекулярных механизмов, которые регулируют регенерацию ткани сосудов через мышиных моделях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Текущий протокол указывает на звук, быстрый, простой, эффективный и воспроизводимый стратегию, при которой функциональные ткани разработаны суда могут быть получены с использованием PiPSC из фибробластов человека. Эта техника представляет собой ценный инструмент для регенеративной ме?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.
Materials
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | Selection of |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
Referências
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
- Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
- Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. Tissue engineering of blood vessel. J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).
- Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
- Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
- Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).
- Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
- Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
- Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
- Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
- Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
- Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
- Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
- Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
- Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
- Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
- Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
- Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
- Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
- Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
