Aqui, apresentamos um protocolo para gerar engenharia de tecidos enxertos de vasos que são funcionais para enxerto em camundongos por semeadura dupla parcialmente célula-tronco pluripotentes induzidas (PPCPE) - derivados de células musculares lisas e PPCPE - células endoteliais derivadas em um biorreator descelulada navio andaime.
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Artigo de método
Geração e Alongamento das embarcações da engenharia de tecidos em um modelo de rato
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A construção de condutos vasculares é uma estratégia fundamental para o reparo cirúrgico de vasos danificados e lesados decorrentes de doenças cardiovasculares. O protocolo atual apresenta uma estratégia eficiente e reprodutível na qual enxertos de vasos de engenharia de tecidos funcionais podem ser gerados usando células-tronco pluripotentes parcialmente induzidas (PiPSC) de fibroblastos humanos. Projetamos um biorreator de andaime de vaso descelularizado, que imita de perto a estrutura da proteína da matriz e o fluxo sanguíneo que existe dentro de um vaso nativo, para semeadura de células endoteliais PiPSC ou células musculares lisas antes do enxerto em camundongos. Essa abordagem demonstrou ser vantajosa porque camundongos imunodeficientes enxertados com enxertos derivados de PiPSC apresentaram taxa de sobrevida acentuadamente aumentada 3 semanas após a cirurgia. Este protocolo representa uma ferramenta valiosa para medicina regenerativa, engenharia de tecidos e terapia celular potencialmente específica do paciente em um futuro próximo.
Introdução
A construção de condutas vasculares é uma estratégia fundamental para a reparação cirúrgica de vasos danificados e feridos resultantes de doenças cardiovasculares. Até à data, materiais de enxerto utilizados em cirurgia incluem biocompatível polímeros sintéticos (politetrafluoretileno [Teflon], politetrafluoretileno expandido [ePTFE; Gore-Tex] ou tereftalato de polietileno [Dacron]), enxertos, tecido autólogo (pericárdio ou veia safena) e xenotransplantes 1. Enquanto enxertos artificiais (por exemplo, Gore-Tex e Dacron) são mais comumente usados, estes materiais provável causar inúmeras complicações a curto e longo prazo que incluem estenose, a de....
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Protocolo
Executar todas as experiências com animais de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de uso e cuidados de animais de laboratório.
1. Preparação de Meios de Cultura
- Adicione meios de cultura para a linha de células de fibroblasto humano CCL-153: F-12K Médio, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina e estreptomicina.
- Adicione reprogramação dos meios para geração de PPCPE: meio de Eagle modificado por KO Dulbecco (DMEM) contendo 20% de substituição KO Soro, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 Mínimo mM Meio Essencial (MEM) não-aminoácidos essenciais, 10 ng / ml do factor de crescimento básico de fibroblastos 2 (b....
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Resultados
A geração bem sucedida de PPCPE foi confirmada 4 dias após nucleofecting fibroblastos humanos com um plasmídeo linearizado pCAG2LMKOSimO transportando quatro fatores de transcrição, Oct4, SOX2, KLF4 e c-Myc (OSKM). PPCPE apresentaram um fenótipo marcadamente distinta quando comparados com os fibroblastos (Figura 2A) e expressa os quatro factores de reprogramação no ARNm (Figura 2B) e de proteína (Figura 2C) 10 níveis. A eficácia de um enxerto vascular com bas.......
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Discussão
O protocolo atual indica um som, rápido, estratégia simples, eficiente e reprodutível em que os navios da engenharia de tecidos funcionais podem ser gerados usando PPCPE a partir de fibroblastos humanos. Esta técnica é uma ferramenta valiosa para a medicina regenerativa, engenharia de tecidos e terapia celular específico paciente potencialmente no futuro próximo. As etapas críticas para assegurar a eficácia do protocolo inclui a preparação de PPCPE, preparação de aórticos descelularizados totalmente estéreis e, semeadur.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros conflitantes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela The British Heart Foundation e pela The Oak Foundation.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fibroblastos Humanos CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Fibroblastos embrionários humanos pré-natais |
| ATCC F-12K Medium (Modificação de Kaighn do Meio F-12 de Ham) | ATCC | 30-2004 | |
| Soro Fetal | Bovino ATCC | 30-2020 | |
| Nocaute Meio DMEM otimizado para células-tronco embrionárias | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| meio alfa-MEM | Tecnologias de vida (Invitrogen) | 32571093 | |
| PDGF humano | R& D System | 120-HD-001 | |
| Solução de Gelatina 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| Enzima de Restrição PvuI | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Kit de Nucelofection (Kit NHDF) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomicina | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Iluminação para Microscopia Estéreo | SCHOTT | KL 1500 LCD | Iluminação de luz fria para microscopia estéreo |
| Esteromicroscópio Zoom Nikon SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Sal de sódio de heparina | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Solução de estoque Reagente de biologia molecular | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg / ml) | BD | A6661 | |
| Agitador IKA Vibrax com plataforma vibratória VX 7 | Jepson Bolton, Janke & Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Bomba Digital Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | A tubulação passa pela bomba peristáltica |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Tubulação de Silicone | SILEX | N/A | As tubulações conectam a câmara de incubação, o reservatório de mídia e a câmara de conformidade |
| Redutor de Conexão 0.5 para 1.6, Polipropilina Natural | Ibidi | 10829 | Adaptador conecta acima dois tipos de tubos |
| /32" Tubulação, ID 0.01" (250µ m) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubulação através da parede da câmara de incubação que conecta o enxerto com a tubulação externa |
| Conexões de uma peça | LabSmith | T-132-100 | Fixe os tubos acima através da parede da câmara de incubação |
| Tubos de nylon (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Os tubos Smiths Medical | N/A | são inseridos em duas extremidades do enxerto de aorta |
| NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl camundongo | Charles River | ||
| Suturas cirúrgicas, 8-0 seda | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgésico para uso em camundongos |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Indução de anestesia |
| Microscópio de dissecação | Carl Zeiss | Tubo de Nylon Stemi 2000 | |
| Portex LTD | 800/200/100/200 | 0,65 mm de diâmetro e 1 mm de comprimento; para fazer manguito de artéria | |
| Eletrocoagulador | Martin | SN 54.131 | Ligadura de ramos da artéria na aorta |
| Micro fórceps hemostático bipolar | Martin | 80-91-12-04 | Fixação das extremidades dos vasos |
| Dilatador de vasos | S & T | JFX-7 | |
| Dilatador de Vaso | S & T | JFL-3dZ | |
| Dilatador de Vaso | S & T | D-5aZ | |
| Mini aplicador | AESCULAP | FE572K | |
| Micro clipes hemostáticos | AESCULAP | FE720K | |
| Suturas cirúrgicas, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
Referências
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr
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Reimpressões e permissões
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