डिजाइन, उपचार, सेलुलर चढ़ाना, और कार्यात्मक आपस में जुड़े सर्किट से बना मॉड्यूलर neuronal नेटवर्क का संवर्धन भूतल
Summary
इस पांडुलिपि स्थानिक तक ही सीमित है, कार्यशील आपस में जुड़े neuronal सर्किट से मिलकर इन विट्रो मॉड्यूलर नेटवर्क में विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। एक polymeric मुखौटा संवर्धन सब्सट्रेट पर सेलुलर आसंजन को बढ़ावा देने के पैटर्न के लिए एक प्रोटीन की परत प्रयोग किया जाता है। मढ़वाया न्यूरॉन्स लेपित क्षेत्रों सहज कनेक्शन की स्थापना और electrophysiological गतिविधि प्रदर्शन पर बढ़ता है।
Abstract
मस्तिष्क समन्वित सक्रियण और neuronal विधानसभाओं के गतिशील संचार के माध्यम से चल रही है। एक प्रमुख खुला प्रश्न सबसे विविध मस्तिष्क कार्यों आबाद जो dynamical रूपांकनों का एक विशाल प्रदर्शनों की सूची, मस्तिष्क सर्किट का एक निश्चित और topological मॉड्यूलर संगठन से बाहर उभर सकता है। आंतरिक प्रयोगात्मक कठिनाइयों पेश जो neuronal सर्किट के vivo अध्ययनों की तुलना में, इन विट्रो तैयारी में हेरफेर और प्रयोगात्मक न्यूरोनल सिस्टम की, संरचनात्मक dynamical और रासायनिक गुणों की जांच के लिए एक बहुत बड़ा संभावना प्रदान करते हैं। इस काम के स्थानिक अलग, कार्यात्मक परस्पर न्यूरोनल विधानसभाओं द्वारा रचित मॉड्यूलर नेटवर्क की बढ़ती अनुमति देता है एक में इन विट्रो प्रयोगात्मक कार्यप्रणाली का वर्णन है। प्रोटोकॉल के topological जटिलता के विभिन्न स्तरों पर neuronal नेटवर्क के दो-आयामी (2 डी) वास्तुकला को नियंत्रित करने की अनुमति देता है।
एक वांछित नेटवर्क patterning के हो सकते हैंनियमित रूप से कवर फिसल जाता है और सब्सट्रेट एम्बेडेड माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों पर दोनों हासिल की। Micromachined संरचनाओं एक सिलिकॉन वेफर पर उभरा और इच्छित नेटवर्क वास्तुकला के नकारात्मक सुविधाओं को शामिल जो biocompatible है बहुलक स्टेंसिल, बनाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। स्टेंसिल सेलुलर आसंजन को बढ़ावा देने के लिए एक आणविक परत के साथ सतह कोटिंग प्रक्रिया के दौरान संवर्धन substrates पर रखा जाता है। स्टेंसिल के हटाने के बाद, न्यूरॉन्स चढ़ाया जाता है और वे अनायास लेपित क्षेत्रों के लिए निर्देशित कर दिये। अंतर-कम्पार्टमेंट दूरी कम करके, यह अलग या परस्पर या तो neuronal सर्किट प्राप्त करने के लिए संभव है। सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लिए, कोशिकाओं संस्कृति पकवान की परिधि में स्थित है जो एक का समर्थन neuronal नेटवर्क के साथ सह-सुसंस्कृत हैं। सब्सट्रेट एम्बेडेड माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों और कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके क्रमशः प्राप्त मॉड्यूलर नेटवर्क की गतिविधि के electrophysiological और ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग प्रस्तुत कर रहे हैं। प्रत्येक मॉड्यूल spont से पता चलता है, जबकिaneous वैश्विक सिंक्रनाइज़ेशंस, अंतर मॉड्यूल तुल्यकालन की घटना सर्किट के बीच कनेक्शन के घनत्व के द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
Introduction
प्रायोगिक और सैद्धांतिक सबूतों मस्तिष्क क्षणिक एक दूसरे को आकार देने और अंतर्निहित अलग मस्तिष्क राज्यों के साथ बातचीत कि गतिशील कार्यात्मक इकाइयों के रूप में माना जा सकता है, जो सेल विधानसभाओं 1-5 की समन्वित सक्रियण, के माध्यम से संचालित की संभावना है कि समर्थन करते हैं। कार्यात्मक प्रतिरूपकता भी पर निर्भर है और मस्तिष्क सर्किट 6,7 के संरचनात्मक मॉड्यूलर संगठन के साथ जुड़ा हुआ है। कैसे समारोह और मस्तिष्क सर्किट की संरचना परस्पर एक दूसरे को आकार अभी भी तंत्रिका विज्ञान में मुख्य खुला सवालों में से एक है। इस सवाल का एक गहरी समझ प्रदान करने के लिए है, इसे संबोधित करने के लिए संभव है, जहां कम से कम आंशिक रूप से, उन मुद्दों इष्टतम प्रयोगात्मक व्यवस्थाएं की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। इन विवो प्रयोगों में neuronal नेटवर्क के spatio- लौकिक गतिशीलता के हेरफेर नियंत्रित चूंकि इन विट्रो neuronal नेटवर्क मॉडल के विकास के कारण उनके लिए आसान एसीसी के लिए महत्वपूर्ण ब्याज की है, चुनौती दे रहा हैessibility, निगरानी, हेरफेर और 8,9 मॉडलिंग। हाल के वर्षों में, उन्नत सब्सट्रेट patterning के तरीकों द्वारा समर्थित विट्रो प्रौद्योगिकियों में पूर्वनिर्धारित मॉड्यूलर संरचनाओं तीन की एक श्रृंखला विकसित करने के लिए और लगाया टोपोलोजी 10 के साथ नेटवर्क के कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए neuronal नेटवर्क प्रेरित करने के लिए अनुमति दी है। विशेष रूप से, विधियों हाल ही में शारीरिक बाधाओं 4,11 लगाने से नेटवर्क व्यवस्थित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। दरअसल, neuronal नेटवर्क में संरचना और समारोह के बीच की कड़ी का अध्ययन करने और neuronal विधानसभाओं बातचीत का एक सरल लेकिन प्रशंसनीय प्रतिनिधित्व प्रदान करने के लिए इन विट्रो सिस्टम आपस में जुड़े न्यूरोनल उप आबादी प्रदान करना चाहिए। व्यापक रूप से अध्ययन 2D समरूप neuronal संस्कृतियों सर्किट के स्वयं संगठित आकस्मिक तारों पर किसी भी स्थानिक बाधाओं लागू नहीं है। इसलिए एक संभव दृष्टिकोण विवाद में अलग neuronal आबादी की स्थिति के लिए कृत्रिम रूप से परस्पर सेल विधानसभाओं है आकार करने के लिएially अलग क्षेत्रों। इन क्षेत्रों के बीच दूरी इंटर विधानसभाओं कनेक्शन नहीं रोकता है। नेटवर्क जटिलता पर एक काफी नियंत्रण सुनिश्चित करते हुए यह दृष्टिकोण, तुल्यकालन मॉडल 6,7,12 के एक अमीर प्रदर्शनों की सूची उपलब्ध कराने के लिए दिखाया गया है।
मॉड्यूलर न्यूरोनल विधानसभाओं की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संवर्धन की सुविधा के लिए आदेश में, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया और वर्णन किया गया है axons और dendrites से जुड़े न्यूरोनल समूहों में नेटवर्क की आत्म संगठन को इकट्ठा करने के लिए। neuronal संस्कृतियों के भौतिक प्रसूति के लिए बहुलक संरचना polydimtheylsiloxane (PDMS) से बनाया गया है। PDMS व्यापक रूप से गैसों से 13 अपने biocompatibility, पारदर्शिता और पारगम्यता के कारण जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल एक elastomer है। PDMS स्पिन कोटिंग जैकमैन एट अल में पहले से वर्णित के रूप में एक 'मास्टर' पर एक तरल PDMS। 16 टी द्वारा 2075 14,15 संरचनाओं तैयार है और micromachined SU8 से बाहर रखा गया हैवह अलग-अलग आकार के आपस में जुड़े मॉड्यूल से बना रहे हैं neuronal नेटवर्क नमूनों हासिल की है और वे सफलतापूर्वक दोनों coverslips और माइक्रो इलेक्ट्रोड सरणियों (meas) 17-20 पर प्राप्त किया गया है। मॉड्यूल के बीच कनेक्शन का घनत्व मॉड्यूल के बीच तुल्यकालन के क्षणिक राज्य अमेरिका के लिए, वर्दी संस्कृतियों के ठेठ एक पूरी तरह से सिंक्रनाइज़ नेटवर्क, से, नेटवर्क तुल्यकालन की सुविधाओं को बदल सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
कार्यात्मक आपस में जुड़े सर्किट से बना विट्रो में 2 डी मॉड्यूलर neuronal नेटवर्क विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रक्रिया एक सेलुलर चिपकने वाला परत patterning पर आधारित है। Patterning PDMS स्टेंसिल वांछित…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम में यूरोपीय परियोजना BRIANBOW (FP7- युवा खोजकर्ता द्वारा समर्थित किया गया था, लेखकों पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए डॉ Jacopo Tessadori का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और वीडियो में इस्तेमाल किया ग्राफिक्स के निर्माण में उसकी मदद के लिए सिल्विया Chiappalone होगा।
Materials
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene Vacuum Chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-Lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin Coater | Laurell – Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12 well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| silicone grease – SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: www.microchem.com |
Referências
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
