Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

Omdat eiwitvarianten spelen cruciale rol bij vele ziekten waaronder TDP-43 in Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS), alfa-synucleine in Parkinson en beta-amyloïde en tau in de ziekte van Alzheimer, is het uiterst belangrijk om morfologie specifieke reagentia die selectief kunnen richten ontwikkelen Deze ziekte-specifiek eiwit varianten om de rol van deze varianten bestuderen pathologie en voor potentiële diagnostische en therapeutische toepassingen. We hebben nieuwe atomic force microscopie (AFM) gebaseerd biopanning technieken die isolatie van reagentia die ziektespecifieke eiwitvarianten selectief weer herkent ontwikkeld. Er zijn twee belangrijke fasen in het proces, de negatieve en positieve panning fasen. Tijdens de negatieve panning fase worden fagen die reactief naar off-target antigenen zijn geëlimineerd door middel van meerdere rondes van subtractieve panning gebruik te maken van een reeks van zorgvuldig geselecteerde off-target antigenen. Een belangrijk kenmerk in de negatievepanning fase wordt met behulp van AFM beeldvorming om het proces te bewaken en te bevestigen dat alle faagpartikels ongewenst worden verwijderd. Voor de positieve panning fase wordt het doelantigeen plaats gefixeerd op een mica oppervlak gebonden fagen geëlueerd en gescreend op fagen die selectief het doelantigeen binden identificeren. Het doeleiwit variant hoeft niet te worden gezuiverd om een ​​geschikte negatieve panning controles werden gebruikt. Zelfs doelwiteiwit varianten die alleen aanwezig in zeer lage concentraties in complexe biologische materiaal kan worden gebruikt in de positieve panning stap zijn. Door toepassing van deze technologie, verkregen we antilichamen tegen eiwit varianten van TDP-43 die selectief worden aangetroffen in menselijk ALS hersenweefsel. We verwachten dat dit protocol geldende zijn aan productie reagentia die selectief eiwitten varianten aanwezig in een groot aantal verschillende biologische processen en ziekten binden.

Introduction

De aanwezigheid van eiwit varianten is geïmpliceerd als een factor in de progressie van vele ziekten zoals neurodegeneratieve ziekten, zoals Alzheimer, Parkinson, ALS en frontotemporale dementie (FTD) ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11.} Oligomere vormen van de eiwitten beta-amyloïde en alfa-synucleïne worden gedacht aan toxische stoffen verantwoordelijk voor Alzheimer en Parkinson respectievelijk ^2,3,4,5 zijn. Aggregaten van het TAR DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) zijn gekoppeld aan ALS en FTD ^12,13,14. Daarom reagentia zoals antilichamen die selectief kunnen richten op de verschillende eiwit varianten kan een krachtig instrument om als diagnostische markers en potentiële therapeutische dienen. In deze studie hebben we gericht op het ontwikkelen reagentia die selectief varianten van TDP-43 proteïne betrokken bij ALS binden, maar de techniek die in dit document dienen voor de isolatie van reagentia tegen een breed scala van protein varianten.

Cytoplasmatische aggregatie van TDP-43 is geïdentificeerd als een pathologische functie in ALS ^{15,16,17,18,19.} Typisch TDP-43 wordt gevonden in de kern van cellen van een normaal individu, hoewel het de neiging om tussen de cytosol en de kern ^15,17. In ALS geaggregeerde vormen van TDP-43 zijn gedetecteerd in het cytoplasma van geselecteerde neuronen en glia met lagere concentraties in de kern suggereert de beweging van TDP-43 van de kern naar het cytoplasma tijdens ziekteprogressie ^16,20. Terwijl de aggregatie van TDP-43 wordt gevonden in de meeste ALS gevallen is het niet goed voor alle gevallen vanaf 1% -2% van de totale ALS gevallen (15% -20% van familiale ALS gevallen) zijn verbonden met mutaties in de superoxide dismutase 1 (SOD1) gen ^15,17. Vanwege de belangrijke rol van TDP-43 in de meeste ALS gevallen hier richten we ons op het ontwikkelen antilichamen gebaseerde reagentia die selectief kan binden aan TDP-43 varianten dieaanwezig in menselijke ALS hersenweefsel gebruik te maken van onze nieuwe AFM gebaseerd biopanning technieken.

In eerste instantie hebben we een divers repertoire van antilichaam bindende domeinen. Wij gecombineerde drie faagdisplay enkele keten variabel domein antilichaamfragmenten (scFvs) bibliotheken (Tomlinson I en J en Sheets bibliotheken ^21). De panning proces is verdeeld in negatieve en positieve panning fasen. Fagen van de bibliotheken worden eerst onderworpen aan de negatieve panning proces waarbij fagen reactief meerdere off-target antigenen uitgesloten. Na voltooiing van elke ronde van panning negatief tegen elkaar off-doelantigeen, wordt het proces gecontroleerd door AFM beeldvorming zodat alle faagbinding de off-target antigenen zijn verwijderd. Na te hebben door AFM beeldvorming dat alle reactieve fagen worden verwijderd moeten we overgaan naar het volgende doel. Om reagentia tegen TDP-43 varianten betrokken bij ALS isoleren we gebruik gemaakt van de volgende negatieve panning antigenen: 1) BSA faag die zwak of niet-specifiek binden aan proteïnen te verwijderen; 2) geaggregeerde alpha-synuclein om faag die zich binden aan generieke structurele elementen van geaggregeerde eiwitten te verwijderen; 3) menselijke hersenen weefselhomogenaten om faag die binden aan een eiwit of andere componenten aanwezig zijn in post-mortem monsters van gezonde menselijke hersenweefsel te verwijderen; 4) immunogeprecipiteerd TDP-43 van gezonde menselijke hersenen te faag die zich binden aan alle TDP-43 vormen in verband met gezonde menselijke hersenen te verwijderen; en 5) immunogeprecipiteerd TDP-43 geïsoleerd van FTD hersenhomogenaten om faag dat TDP-43 varianten geassocieerd met niet-ALS pathologie binden verwijderen. Na verwijdering van faag reactieve alle off-target antigenen, heeft vervolgens we de positieve panning fase waarin antilichaam fragmenten die het antigeen van belang bindt worden geïsoleerd, in casu TDP-43 immunologisch van menselijk ALS hersenweefsel. Deze geïsoleerde antilichamen kunnen reactief naar geaggregeerd of gemodificeerde vormen van TDP-43 zijn.

"> Conventionele faag biopanning richt zich vooral op de positieve panning fase ^22,23. Meestal is het doel van belang is geïmmobiliseerd, de faag bibliotheek toegevoegd en gebonden fagen geëlueerd. De fagen worden dan versterkt en toegevoegd aan het doel weer. Deze versterking en broedproces gewoonlijk verscheidene malen herhaald om het percentage positieve bindende fagen verhogen. Hoewel variaties van dit proces zijn uitgebreid gebruikt antilichaamreagentia isoleren tegen een breed scala van doelwit antigenen, ze vereist in het algemeen grote hoeveelheden gezuiverd doelwitantigeen ^{24,25,26, 27,} terwijl onze werkwijze vereist slechts sporen van het doelantigeen. De hier beschreven protocol kan worden gebruikt voor reagentia die selectief binden doel antigenen die bij zeer lage concentraties aanwezig zijn, zonder de noodzaak voor zuivering en de panning direct tegen kan worden uitgevoerd isoleren antigen aanwezig in complexe weefselmonsters. Het gebruik van uitputtend negatieve panning protocollen als geverifieerddoor AFM zorgt ervoor dat klonen geïsoleerd tegen de positieve antigen selectief het doel toen niet gezuiverd of verrijkt moeten binden zelfs.

Kasturirangan en collega's (2003) hebben een soortgelijke negatieve en positieve biopanning proces om antilichamen reactief naar oligomere beta-amyloïde behulp nanogram concentratie van het doelwit ⁵ isoleren uitgevoerd. Hier breiden wij deze werkwijze het genereren van reagentia die selectief binden ziektespecifieke eiwit varianten rechtstreeks uit menselijke weefselmonsters mogelijk. In toekomstige studies zijn we van plan om verder te onderzoeken, niet alleen de diagnostische waarde van de reagentia hier geïsoleerd, maar ook hun therapeutische relevantie voor de behandeling van ALS.

Kortom, zou onze nieuwe AFM gebaseerd biopanning technologie voor de isolatie van een ziekte-specifiek eiwit variant elk biologisch materiaal zonder eiwitzuivering of modificatie, zelfs wanneer het doelantigeen concentrations zijn extreem laag.

Protocol

1. faagproductie Voer alle faag productie en biopanning processen in een bioveiligheid kast. Opbrengst fagen deeltjes uit de verschillende bibliotheken (Tomlinson I en J bibliotheken en Sheets bibliotheek 21) voor het biopanning werkwijze volgens de instructies van de fabrikant (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). OPMERKING: We maken gebruik van meerdere bibliotheken in onze panning proces om de diversiteit van de beschikbare antilichamen te verhogen. …

Representative Results

In figuur 1 het schema toont de negatieve panning proces waardoor we verwijderd faagbinding off-target antigenen uit onze bibliotheek met behulp immuunbuizen. We aanvankelijk begonnen met BSA omdat dit een gemeenschappelijk blokkerend middel en eventuele faag die niet-specifiek zou reageren met deze doelstelling problematisch toekomst immunoassays zijn. Vervolgens verwijderden we bindmiddelen geaggregeerde alfa-synucleïne faag die reactief met generieke structuren van geaggregeerde eiwitten (bijvoo…

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tomlinson I and J Libraries	MRC (Cambridge, England)
Sheets Library	MRC (Cambridge, England)
2xYT	BD Sciences	244020
Glucose	Amresco	0188-2.5KG
Ampicillin	Amresco	0339-25G	Irritant
KM13 Helper Phage	MRC (Cambridge, England)
Kanamycin	OmniPur	5880	Irritant
Polyethylene Glycol 8000	OmniPur	6510	Irritant
Sodium Chloride	Macron	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Amresco	0404-1KG	Irritant
Potassium Chloride	EMD	PX1405-1	Irritant
Potassium Phosphate Monobasic	Amresco	0781-500G	Irritant
TG1 Cells	MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar	EMD	1.10283.0500
Bovine Serum Albumin	Amresco	0332-100G
STEN buffer	Crystalgen Inc.	33429775
Immunotubes	Thermo Scientific	470319
Mica	Spruce Pine Mica	24365
Tween 20	EMD
Trypsin	Sigma	T-0303	Irritant
Triethylamine	Sigma	T-0886	Flammable
Glycerol	Amresco	0854-1L	Irritant
DNA Plasmid Prep Kit	qiagen	27106	Irritant
Non-Fat Milk Powder	Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate	Costar	3590
Anti-M13 HRP	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit	Thermo Scientific	37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody	ProteinTech	10782-2-AP
A/G Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 Cells	MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside	Teknova	13325
9e10 HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
Nitrocellulose Membrane	Biorad	162-0115	Flammable
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope	Veeco
AFM Probes	VistaProbes	T300R-10