Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

Debido variantes de proteínas juegan un papel crítico en muchas enfermedades incluyendo TDP-43 en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la alfa-sinucleína en la enfermedad y el beta-amiloide y tau en la enfermedad de Alzheimer, es de vital importancia para el desarrollo de reactivos específicos morfología que pueden dirigirse selectivamente Parkinson estas proteínas específica de la enfermedad variantes para estudiar el papel de estas variantes en la patología de la enfermedad y para posibles aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Hemos desarrollado nuevos microscopía de fuerza atómica (AFM) técnicas biopanning base que permiten el aislamiento de los reactivos que reconocen selectivamente variantes de proteínas específicas de la enfermedad. Hay dos fases clave implicados en el proceso, las fases de panning negativos y positivos. Durante la fase de panning negativo, los fagos que son reactivos a los antígenos fuera de objetivo se eliminan a través de múltiples rondas de cribado sustractiva utilizando una serie de antígenos cuidadosamente seleccionados fuera de objetivo. Una característica clave de la negativafase de la panorámica es la utilización de imágenes de AFM para vigilar el proceso y confirmar que se eliminan todas las partículas de fago no deseados. Para la fase de panning positivo, el antígeno diana de interés se fija sobre una superficie de mica y fagos unidos se eluyen y se tamiza para identificar los fagos que se unen selectivamente al antígeno diana. La variante de proteína diana no necesita ser purificado proporcionando los controles negativos apropiados de panning se han utilizado. Incluso objetivo variantes de proteínas que sólo están presentes en concentraciones muy bajas en el material biológico complejo se puede utilizar en la etapa de panning positivo. A través de la aplicación de esta tecnología, hemos adquirido anticuerpos contra proteínas variantes de TDP-43 que se encuentran de forma selectiva en el tejido cerebral ALS humana. Esperamos que este protocolo debe ser aplicable a la generación de reactivos que se unen selectivamente variantes de proteínas presentes en una amplia variedad de diferentes procesos biológicos y enfermedades.

Introduction

La presencia de variantes de la proteína ha sido implicado como un factor en la progresión de muchas enfermedades, incluyendo enfermedades neurodegenerativas tales como Alzheimer, Parkinson, ALS y la demencia frontotemporal (FTD) ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11.} Formas oligoméricas de las proteínas beta-amiloide y la alfa-sinucleína se cree que son las especies tóxicas responsables de la enfermedad de Alzheimer y el Parkinson, respectivamente ^2,3,4,5. Agregados de la TAR DNA-proteína de unión 43 (TDP-43) se han relacionado con ALS y FTD ^12,13,14. Por lo tanto los reactivos como los anticuerpos que se dirigen selectivamente las diferentes variantes de la proteína pueden ser herramientas poderosas para servir como marcadores de diagnóstico y terapéuticos potenciales. En este estudio, se centró en el desarrollo de reactivos que se unen selectivamente variantes de la proteína TDP-43 implicados en la ELA, sin embargo, la técnica descrita en este documento debe ser aplicable al aislamiento de los reactivos frente a una amplia gama de protein variantes.

La agregación citoplásmica de TDP-43 ha sido identificada como una característica patológica en la ELA ^{15,16,17,18,19.} Típicamente TDP-43 se encuentra en el núcleo de todas las células de un individuo normal, aunque tiende a desplazarse entre el citosol y el núcleo ^15,17. Formas Sin embargo, en ALS agregados de TDP-43 se detectan en el citoplasma de neuronas y glia seleccione con concentraciones más bajas se encuentran en el núcleo lo que sugiere el movimiento de TDP-43 desde el núcleo hasta el citoplasma durante la progresión de la enfermedad ^16,20. Mientras la agregación de TDP-43 se encuentra en la mayoría de los casos de ELA, que no tiene en cuenta todos los casos desde el 1% -2% de los casos de ELA total (o 15% -20% de los casos de ELA familiar) están vinculados a mutaciones en el superóxido dismutasa 1 (SOD1) ^15,17 gen. Debido a la importancia del papel de TDP-43 en la gran mayoría de los casos de ELA, aquí nos centramos en el desarrollo de reactivos de anticuerpos basados ​​que pueden unirse selectivamente a TDP-43 variantes que sonpresente en el tejido cerebral ALS humana utilizando nuestras técnicas biopanning basado novela AFM.

Inicialmente tenemos un repertorio diverso de los dominios de unión a anticuerpos. Se combinaron los tres (scFv) bibliotecas de fragmentos diferentes de presentación de fagos de cadena único dominio variable de anticuerpo, (Tomlinson I y J y Hojas de bibliotecas ^21). El proceso de toma panorámica se divide en fases de panorama negativo y positivo. Los fagos de las bibliotecas son primero sometidos al proceso de panning negativo durante el cual los fagos reactivo a múltiples antígenos están excluidos desviado. Después de la finalización de cada ronda de selección negativa contra cada antígeno fuera del objetivo, el proceso se controla por imágenes de AFM para asegurar que toda fago de unión a los antígenos fuera de objetivo se han eliminado. Sólo después de verificar por AFM de imágenes que se eliminan todos los fagos reactivos Qué podemos hacer para el próximo objetivo. Para aislar reactivos contra TDP-43 variantes implicadas en la ELA hemos utilizado los siguientes antígenos paneo negativos: 1) BSA para eliminar los fagos que se unen débilmente o no específicamente a las proteínas; 2) agregada alfa-sinucleína para eliminar los fagos que se unen a elementos estructurales genéricas de agregados de proteínas; 3) homogeneizados de tejido cerebral humano para eliminar los fagos que se unen a cualquiera de las proteínas u otros componentes presentes en las muestras post-mortem del tejido cerebral humano sano; 4) inmunoprecipitada TDP-43 a partir de cerebro humano sano para eliminar los fagos que se unen a todos TDP-43 formularios relacionados con el cerebro humano sano; y 5) inmunoprecipita TDP-43 aislada de homogeneizados de cerebro FTD para eliminar los fagos que se unen TDP-43 variantes asociadas con la no-ELA patología. Después de la eliminación de todos fago reactivo a todos los antígenos fuera de objetivo, se procedió entonces a la fase de panning positivo durante el cual se aíslan fragmentos de anticuerpos que se unen al antígeno de interés, en este caso TDP-43 inmunoprecipitada a partir de tejido cerebral ALS humana. Estos anticuerpos aislados pueden ser reactivos a las formas de TDP-43 agregados o modificados.

"> Biopanning fago convencional se centra principalmente en la fase de panning positivo ^22,23. Por lo general, la diana de interés se inmoviliza, la biblioteca de fagos añadió y los fagos unidos se eluyó. Los fagos se amplifican y se añade a la meta de nuevo. Este proceso de amplificación y la incubación por lo general se repite varias veces para aumentar el porcentaje de fagos de unión positiva. Si bien las variaciones de este proceso se han utilizado ampliamente para aislar reactivos de anticuerpos contra una amplia gama de antígenos diana, por lo general requiere grandes cantidades de antígeno diana purificada ^{24,25,26, 27,} mientras que nuestro proceso sólo requiere pequeñas cantidades de antígeno diana. El protocolo descrito aquí se puede utilizar para aislar reactivos que se unen selectivamente a antígenos diana que están presentes en concentraciones muy bajas, sin la necesidad de purificación y la panoramización se pueden realizar directamente contra antígeno presente en muestras de tejidos complejos. El uso de protocolos de panning negativos exhaustivos que se han verificadopor AFM asegura que los clones aislados contra el antígeno positivo deben unirse selectivamente el objetivo incluso cuando no purificada o enriquecida.

Kasturirangan y colaboradores (2003) han llevado a cabo un proceso biopanning negativa y positiva similar para aislar anticuerpos reactivos a oligomérica beta-amiloide mediante la concentración de nanogramos del objetivo ^5. Aquí ampliar este proceso para permitir la generación de reactivos que se unen selectivamente a la proteína específica de la enfermedad variantes directamente a partir de muestras de tejidos humanos. En estudios futuros se pretende investigar más a fondo no sólo el valor de diagnóstico de los reactivos aislados aquí, sino también evaluar su relevancia terapéutica para el tratamiento de ALS.

En general, nuestra nueva tecnología basada biopanning AFM debe ser aplicable al aislamiento de cualquier variante de proteína específica de la enfermedad en cualquier material biológico sin la necesidad de purificación de proteínas o modificación, incluso cuando el antígeno diana concentrations son extremadamente bajos.

Protocol

1. Los fagos Producción Realizar todos los procesos de producción de fagos y biopanning en un gabinete de bioseguridad. Producir fagos partículas de las diferentes bibliotecas (Tomlinson I y J bibliotecas y Hojas de biblioteca 21) para el proceso de biopanning utilizando las instrucciones del fabricante (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). NOTA: Nosotros usamos varias bibliotecas en nuestro proceso de exploración para aumentar la diversidad de los …

Representative Results

En la Figura 1, el esquema muestra el proceso paneo negativo por el cual hemos eliminado fago de unión fuera de objetivo antígenos de nuestra biblioteca utilizando inmunotubos. Inicialmente Empezamos con BSA ya que este es un agente de bloqueo común y cualquier fagos que reaccionan de forma no específica con este objetivo sería problemático en inmunoensayos futuras. A continuación, hemos eliminado aglutinantes a agregados de alfa-sinucleína para eliminar los fagos que son reactivos con estructur…

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tomlinson I and J Libraries	MRC (Cambridge, England)
Sheets Library	MRC (Cambridge, England)
2xYT	BD Sciences	244020
Glucose	Amresco	0188-2.5KG
Ampicillin	Amresco	0339-25G	Irritant
KM13 Helper Phage	MRC (Cambridge, England)
Kanamycin	OmniPur	5880	Irritant
Polyethylene Glycol 8000	OmniPur	6510	Irritant
Sodium Chloride	Macron	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Amresco	0404-1KG	Irritant
Potassium Chloride	EMD	PX1405-1	Irritant
Potassium Phosphate Monobasic	Amresco	0781-500G	Irritant
TG1 Cells	MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar	EMD	1.10283.0500
Bovine Serum Albumin	Amresco	0332-100G
STEN buffer	Crystalgen Inc.	33429775
Immunotubes	Thermo Scientific	470319
Mica	Spruce Pine Mica	24365
Tween 20	EMD
Trypsin	Sigma	T-0303	Irritant
Triethylamine	Sigma	T-0886	Flammable
Glycerol	Amresco	0854-1L	Irritant
DNA Plasmid Prep Kit	qiagen	27106	Irritant
Non-Fat Milk Powder	Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate	Costar	3590
Anti-M13 HRP	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit	Thermo Scientific	37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody	ProteinTech	10782-2-AP
A/G Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 Cells	MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside	Teknova	13325
9e10 HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
Nitrocellulose Membrane	Biorad	162-0115	Flammable
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope	Veeco
AFM Probes	VistaProbes	T300R-10