Novel Atomic Force Mikros Basert Biopanning for isolering av morfologi spesifikke reagenser mot TDP-43 Varianter i Amyotrofisk lateral sklerose

Summary

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Abstract

Fordi proteinvarianter spille kritiske roller i mange sykdommer inkludert TDP-43 i amyotrofisk lateral sklerose (ALS), alpha-synuclein in Parkinsons sykdom og beta-amyloid og tau ved Alzheimers sykdom, er det av avgjørende betydning å utvikle morfologi spesifikke reagenser som selektivt kan målrette varianter disse sykdomsspesifikt protein for å studere rollen til disse variantene i sykdomspatologien og for potensielle diagnostiske og terapeutiske anvendelser. Vi har utviklet nye atomkraftmikroskopi (AFM) basert biopanning teknikker som gjør det mulig isolering av reagenser som selektivt gjenkjenner sykdomsspesifikke proteinvarianter. Det er to hovedfaser som er involvert i prosessen, de negative og positive panorering faser. I løpet av den negative fasen panorering, er fager som er reaktive til off-målantigener eliminert gjennom flere runder med panorering subtraktiv benytte en serie nøye utvalgte off-target-antigenene. En viktig funksjon i negativpanning fase utnytte AFM avbildning for å overvåke prosessen og få bekreftet at alle uønskede fag-partikler fjernes. For den positive fasen panorering, blir target-antigenet av interesse festet på et mica overflate og bundet Fagene blir eluert og undersøkt for å identifisere fager som selektivt binder mål-antigen. Målproteinet variant behøver ikke å bli renset tilveiebringe de nødvendige negative kontroller med panning har blitt brukt. Selv målrette proteinvarianter som kun er tilstede i meget lave konsentrasjoner i komplekse biologiske materiale kan benyttes i den positive panorering trinn. Gjennom anvendelse av denne teknologien, kjøpte vi antistoffer mot protein varianter av TDP-43 som er selektivt funnet i menneskelig ALS hjernevev. Vi regner med at denne protokollen bør være aktuelt å generere reagenser som selektivt binder proteinvarianter som er tilstede i en rekke forskjellige biologiske prosesser og sykdommer.

Introduction

Nærværet av proteinvarianter har vært implisert som en faktor i utviklingen av mange sykdommer som omfatter nevrodegenerative sykdommer, slik som Alzheimer, Parkinson, ALS, og frontotemporal demens (FTD) ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11.} Oligomere former av proteinene beta-amyloid og alpha-synuclein er antatt å være de toksiske artene som er ansvarlige for Alzheimers og Parkinsons henholdsvis ^2,3,4,5. Aggregater av TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43) har vært knyttet til ALS og FTD ^12,13,14. Derfor reagenser slik som antistoffer som selektivt kan målrette de ulike proteinvarianter kan være kraftige verktøy for å tjene som diagnostiske markører og potensielle behandlingsformer. I denne studien har vi fokusert på å utvikle reagenser som selektivt binder varianter av TDP-43 protein innblandet i ALS, men teknikken er skissert i dette papiret bør være aktuelt for isolering av reagenser mot et bredt spekter av protein varianter.

Cytoplasmatisk aggregering av TDP-43 har blitt identifisert som et patologisk trekk i ALS ^{15,16,17,18,19.} Vanligvis TDP-43 er funnet i kjernen av alle celler fra en normal person, selv om det har en tendens til å bevege seg mellom cytosol og kjerne ^15,17. Men i ALS aggregerte former av TDP-43 blir detektert i cytoplasma av utvalgte neuroner og glia med lavere konsentrasjoner som finnes i kjernen som tyder på bevegelsen av TDP-43 fra kjernen til cytoplasma under sykdomsprogresjon ^16,20. Mens aggregering av TDP-43 er funnet i de fleste ALS tilfellene, betyr det ikke høyde for alle tilfeller siden 1% -2% av totale ALS tilfeller (eller 15% -20% av familiære ALS tilfeller) er knyttet til mutasjoner i superoksyddismutase 1 (SOD1) genet ^15,17. På grunn av den viktige rollen TDP-43 i de aller fleste ALS tilfeller her vi fokusere på å utvikle antistoffbasert reagenser som selektivt kan binde seg til TDP-43 varianter som ertil stede i menneskets ALS hjernevev utnytte våre roman AFM basert biopanning teknikker.

I første omgang trenger vi et variert repertoar av antistoff bindende domener. Vi kombinerte tre forskjellige fagfremvisning enkelt kjede variabel domene antistoffragment (scFv) biblioteker, (Tomlinson I og J og Sheets biblioteker ^21). Panning-prosessen er delt i negative og positive panorering faser. Fager fra bibliotekene blir først utsatt for den negative panorering prosessen under hvilken fager reaktiv til flere off-target-antigenene er utelukket. Etter fullførelsen av hver runde med panorering negativ mot hverandre off-target-antigenet, er prosessen overvåkes av AFM avbildning for å sikre at alle fag binding off-target-antigenene har blitt fjernet. Etter å ha kontrollert av AFM tenkelig at alle reaktive fag blir fjernet vi gå videre til det neste målet. Å isolere reagenser mot TDP-43 varianter innblandet i ALS vi benyttet følgende negative panorering antigener: 1) BSA for å fjerne fag som binder svakt eller ikke-spesifikt til proteiner; 2) aggregerte alpha-synuclein å fjerne fag som binder til generiske strukturelementer av aggregerte proteiner; 3) human hjerne vevshomogenater å fjerne fag som binder seg til eventuelle proteiner eller andre komponenter som er tilstede i post-mortem prøver av friske humane hjernevevet; 4) immunopresipitert TDP-43 fra sunne menneskelige hjerne å fjerne fag som binder til alle TDP-43 former forbundet med sunne menneskelige hjerne; og 5) immunopresipitert TDP-43 isolert fra FTD hjerne-homogenater å fjerne fag som binder TDP-43 varianter i forbindelse med ikke-ALS patologi. Etter fjerning av alt fagen reaktive til alle off-target-antigenene, vi fortsatte deretter til den positive panorering fase der antistoff-fragmenter som binder antigenet av interesse blir isolert, i dette tilfellet TDP-43 immunopresipitert fra humane ALS hjernevev. Disse isolerte antistoffer kan være reaktivt til aggregerte eller modifiserte former av TDP-43.

"> Konvensjonell fag biopanning hovedsak fokuserer på det positive panorering fase ^22,23. Vanligvis målet om interessen er immobilisert, lagt fagbibliotek og innbundne fager elueres. Fagene blir så forsterket og lagt til målet igjen. Denne forsterkningen og inkubasjon prosess blir vanligvis gjentatt flere ganger for å øke prosentandelen av positive fag-binding. Selv om variasjoner av denne fremgangsmåte er blitt brukt i stor utstrekning for å isolere antistoffreagenser mot et bredt spekter av mål-antigener, krever de vanligvis store mengder av renset målantigen ^{24,25,26, 27,} mens foreliggende fremgangsmåte krever bare spormengder av målantigenet. Protokollen er beskrevet her kan brukes til å isolere reagenser som selektivt binder mål-antigener som er til stede i meget lave konsentrasjoner, uten behov for rensing, og panorering kan utføres direkte mot antigen stede i komplekse vevsprøver. Bruken av uttømmende negative panorering protokoller som bekreftetav AFM sikrer at kloner isolert mot den positive antigen bør selektivt binde målet, selv når det ikke er renset eller anriket.

Kasturirangan og kolleger (2003) har gjennomført en lignende negativ og positiv biopanning prosess for å isolere antistoffer reaktive til oligomert beta-amyloid bruker nanogram konsentrasjon av målet ^fem. Her har vi utvide denne prosess til å muliggjøre generering av reagenser som selektivt binder sykdomsspesifikt protein varianter direkte fra humane vevsprøver. I fremtidige studier skal vi undersøke nærmere ikke bare den diagnostiske verdien av reagenser isolert her, men også vurdere deres terapeutiske relevans for behandling av ALS.

Samlet vår nye AFM basert biopanning teknologi bør være anvendelig til isolering av en hvilken som helst sykdomsspesifikk proteinvariant i hvilken som helst biologisk materiale uten behov for proteinrensing eller modifisering, selv om ønsket antigen-konsentrasjonns er ekstremt lav.

Protocol

1. Fag Produksjon Utføre alle fag produksjons- og biopanning prosesser i en biosikkerhet kabinett. Produsere fager partikler fra de forskjellige bibliotekene (Tomlinson I og J biblioteker og blad bibliotek 21) for biopanning prosessen ved hjelp av produsentens instruksjoner (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf). MERK: Vi bruker flere biblioteker i vår panorering prosess for å øke mangfoldet av antistoffene tilgjengelige. I korthet bakterier…

Representative Results

I figur 1 viser skjematisk den negative panorering prosessen som vi fjernet fag bindende off-target antigener fra vårt bibliotek ved hjelp immunotubes. Vi opprinnelig startet med BSA, siden dette er et vanlig blokkeringsmiddel, og ethvert fagen som ville reagere ikke-spesifikt med dette målet ville være problematisk i fremtidige immunoanalyser. Deretter fjernet vi permer til aggregert alpha-synuclein å eliminere fag som er reaktiv med generiske strukturer av aggregerte proteiner (dvs. et an…

Discussion

Protein variants have been shown to be involved in the progression of many neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s, ALS and FTD^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}. Isolation of antibodies that can selectively recognize these different protein variant targets can be effective reagents to study, diagnose and potentially treat such ailments. To generate such variant specific antibodies we have developed a novel biopanning process that utilizes atomic force microscopy to monitor the progress …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Tomlinson I and J Libraries	MRC (Cambridge, England)
Sheets Library	MRC (Cambridge, England)
2xYT	BD Sciences	244020
Glucose	Amresco	0188-2.5KG
Ampicillin	Amresco	0339-25G	Irritant
KM13 Helper Phage	MRC (Cambridge, England)
Kanamycin	OmniPur	5880	Irritant
Polyethylene Glycol 8000	OmniPur	6510	Irritant
Sodium Chloride	Macron	7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic	Amresco	0404-1KG	Irritant
Potassium Chloride	EMD	PX1405-1	Irritant
Potassium Phosphate Monobasic	Amresco	0781-500G	Irritant
TG1 Cells	MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar	EMD	1.10283.0500
Bovine Serum Albumin	Amresco	0332-100G
STEN buffer	Crystalgen Inc.	33429775
Immunotubes	Thermo Scientific	470319
Mica	Spruce Pine Mica	24365
Tween 20	EMD
Trypsin	Sigma	T-0303	Irritant
Triethylamine	Sigma	T-0886	Flammable
Glycerol	Amresco	0854-1L	Irritant
DNA Plasmid Prep Kit	qiagen	27106	Irritant
Non-Fat Milk Powder	Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate	Costar	3590
Anti-M13 HRP	GE Healthcare Life Sciences	27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit	Thermo Scientific	37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody	ProteinTech	10782-2-AP
A/G Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
HB 2151 Cells	MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside	Teknova	13325
9e10 HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-40
Nitrocellulose Membrane	Biorad	162-0115	Flammable
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope	Veeco
AFM Probes	VistaProbes	T300R-10