循环的microRNA最近出现的前途和新的生物标志物对各种癌症和其他疾病。本文的目的是讨论三种不同的基于探针的实时PCR平台和可用来量化和确定循环微RNA的丰度的方法。
基于探针的定量PCR(qPCR的)是用于测量转录物丰度的青睐的方法,因为它是,提供了一个准确的和可重复的分析中最灵敏的检测方法之一。基于探针的化学提供了至少背景荧光相对于其他(染料基)化学物质。目前,有可用的使用探针为基础的化学几个平台定量转录丰度。定量PCR在96孔板是最经常使用的方法,但是最多只有96个样品或miRNA的可以在单次运行进行测试。这是费时和乏味,如果有大量的样品/ miRNA是待分析。高通量探针为基础的平台,如微流体技术( 如 TaqMan探针阵列卡)和纳流控阵列( 例如 OpenArray)提供便于可重复地和有效地检测在短时间内在大量样品的多个微RNA的丰度。在这里,我们展示了实验装置一第二协议用于从血清或血浆-EDTA的样品,使用基于探针的化学和三种不同的平台上(96孔板,微流体和纳米流体阵列)提供的吞吐量水平的不断提高的miRNA定量。
微RNA(miRNA)是〜22个核苷酸的非编码(NC)的RNA,功能基因表达1-3监管。大多数的miRNA在动物中通过序列特异性碱基配对与mRNA起作用,靶向的3'端非编码区,从而导致该基因表达2-4的负调控。这通常通过抑制mRNA翻译或核糖体落客发生。在循环的miRNA已被证明是在研究和临床方面新颖的生物标志物用于多种疾病,如糖 尿病5-7,卵巢8,前列腺9和乳腺癌10,11,乙型肝炎12和其他自体免疫疾病13。研究已进行识别丰富的miRNA在不同细胞或组织中,以及在从人血浆和血清样品,这是更方便和更小侵入性9,11-15循环。
miRNA的定量不同的方法已经ê使用多个平台,如标准的96孔板平台4,12,16-18中,微流体卡平台12,18-23和纳流控阵列平台17,24配合建立。定量实时PCR(qPCR的)提供了使用多个(染料 – 或基于探测器)化学来测量转录物的相对或绝对数量的能力。基于探针的实时PCR化学提供了低背景荧光和高灵敏度的益处,以检测单个转录拷贝。它相对成本效益,使用简单和高度可再现,使得它青睐的方法用于量化和确定miRNA的表达25。基于探针的定量PCR方法一般包括两个步骤:逆转录(RT)和定量PCR 4,26,27。 RT是其中所述茎 – 环RT引物杂交到一个成熟或初级miRNA分子,并转换为互补的(三)的DNA。该cDNA产物的定量。然后进行了使用的miRNA特异性PCR引物26-28。基于探针的定量PCR的原理是基于互补链延伸在真实时间,它涉及到荧光标记的探针的水解的检测。这些探针被设计为含有荧光报告和淬灭是刚拆开,以允许FRET(荧光共振能量转移)。检测从荧光记者(发射器)发射的由猝灭剂分子的接近掩蔽。当Taq聚合酶(POL)从上游引物延伸,并到达一个拨叉(该探针的5'端),所述的Taq聚合酶外切核酸酶活性水解探针,导致从所述淬灭剂的荧光发射的一个物理分解/分离。此版本的荧光发射的单个分子的记录由检测并呈现为从该井/反应的荧光信号的增量增加。在荧光的增加正比于PCR产物的产生量,从而允许精确的曲antification扩增的靶26,28。
与miRNA的量化的需求不断增加,中高通量技术已发展到允许在很短的时间量要处理样本的数量较多。的TaqMan低密度阵列(TLDA)是基于基于探针的定量PCR化学介质通量微流体创新设计,提供增加的miRNA在一个板上分析的数量。 TLDA涉及使用被用于合成cDNA的RT-引物的预定池。这些cDNA然后被纺成自定义384以及微流体卡,以确定使用qPCR 22,26,29多种miRNA的表达。在卡的各孔含有干燥的引物和探针,以扩增特异的miRNA(S),因此,多达384个反应可以在单一TLDA卡26进行处理。
的纳流控阵列是一种用于检测基因转录物的高通量平台<sup> 24使用相同的探针为基础的化学反应。它利用一个专有矩阵提供疏水-亲水相互作用以方便装载33纳升的反应混合物的成3072的通孔上的不锈钢幻灯片24的阵列。本文重点介绍演示了如何这些方法量化的血清/血浆miRNA的执行,并且必须在执行和解释这些数据时需要考虑的重要因素。采取的帐户,他们的个人利益和限制将在本文中进行讨论。
内的基于探针的定量PCR的协议的关键步骤,以获得精确的和可再现的结果,以确保1)RT-产品的相同体积和浓度在每个qPCR的反应被装载,2)的部件的正确率和卷所需qPCR的反应制备并充分混合,3)的正确和一致的卷被添加到每个qPCR的反应,和4)每个样品和反应混合物的制备和装载在时间尽可能最短量完成时,同时仍注意到上述关键步骤前面提到的。
微流体阵列卡需要合适的离心机和具体桶。每个桶可容纳3张卡(加载/空)。总是确保一个桶的所有3个时隙被占用并且铲斗通过将类似桶(此铲斗还应包含3卡,或者为空或满)在离心机的相对槽平衡。同时将卡在bucke吨夹持器,确保8储层突出向上和反应孔面对离心机的外壁。旋转卡在331×g离心,在室温下放置1分钟。先旋后,打开离心机和视觉确保反应混合物已经通过384口井被分配。重复旋转,在相同的设置1更多的时间。从桶中取出卡,并确保反应混合物中的8个水库的水平是一致的。任何不一致留在水库的液体量使该卡不恰当的进一步使用。
有RT-产物的相同浓度,RNA的相同的输入浓度被加入到每个RT反应。总RNA的浓度使用微volumespectrophotometer测定。所观察到的二百八分之二百六十零比率可低至1.3用于从血浆/血清中分离的RNA;这似乎没有产生作用于下游的qPCR相关过程或数据生成的30。同样地,260/280比率的此测试的RNA样品1.3-1.7之间,观察到的qPCR无异常影响。
当使用低含量的RNA的样品,如来自生物流体,它可以是难以量化处理之前的RNA。我们建议使用合成穗中的RNA分离和逆转录阶段。根据我们的经验, 拟南芥 miRNA的候补(ATH-的miR-159A和ATH-的miR-172A)是优选的过线虫的miRNA(例如CEL-的miR-39或CEL-的miR-54),这在我们的经验可以具有更高同源性比来自A.拟南芥 。使用这样的阶段特异性尖峰在可占的miRNA的数据跨越测定在不同时间的多个样品的正常化。利用RNA固定输入音量cDNA合成反应还建议32,33。
这里所描述的三个探头基础协议的miRNA定量要求不同数量总RNA输入,不同的工作流程和成本。每个工作流的设计,以满足基于miRNA靶的数目和待分析的样本数不同的吞吐量。随着吞吐量(96 RXN 384 RXN 3072 RXN),每个反应的成本的增加超过单位时间内获得的数据的量减少。因为所有这些平台利用TaqMan探针化学,获得的数据的质量可被预期为相似。的TaqMan定量PCR是一种行之有效的方法,用于识别miRNA的血清/血浆样品9,11,27中的丰度。虽然这里讨论的三个平台共享相同的化学,在将反应体积减少导致转录的检测的动态范围的减小(法尔的RJ 等人 ,未发表的数据)。 96孔定量PCR平台是一个较低的吞吐量,但灵敏度高的平台,并在我们看来,“金标准”为所有基于探测的(或染料为基础)PCR平台。然而,这可能不是最经济或有效的平台如几百或几千个样本被检测和用于多个微RNA。微流体(TLDA)和纳流控(OA)平台设计为允许采集较大的数据在更短的时间高通量/内容平台。尽管批量分歧在TLDA卡被观察,这可以通过从同一批次请求TLDA卡被最小化。我们观察到,TLDA平台( 图3)显示出显著变化中期的17% -低丰度的miRNA在使用上的TLDA卡不同批次的相同的样品进行测试。因此,我们建议使用相同批号使用TLDA卡的分析。此变化也可能是由于该技术可变性,包括任何可能的加载和移液误差。但是,我们建议排序/请求同批TLDA卡。没有显著一批变化观察到OA平台上。尽管如此,基于TaqMan experimenTAL定量PCR方法提供了易用性来衡量血浆/血清样品中的miRNA的丰度。这里讨论的低,中,高通量的方法提供了用于分析范围使用一种高效的,可重复和干净的(低的背景噪声)化学样品和miRNA的灵活性。
The authors have nothing to disclose.
所有的作者承认从NHMRC CTC,悉尼,青少年糖尿病研究基金会(JDRF),澳大利亚的大学和丽贝卡·库珀基金会,澳大利亚的基础设施支持。这项研究是通过由澳大利亚研究理事会(FT110100254)和JDRF,澳大利亚(CRN201314)赠款,以AAH WW,配花量和MVJ进行全湿实验室实验,ASJ进行了数据分析。 WW写的第一稿。 AAH计划的研究和分析数据。所有作者阅读并同意提交出版的手稿,人物和工作表的最终版本。
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |