순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.
이 정확하고 재현성있는 분석을 제공 가장 민감한 검출 방법 중 하나이기 때문에 프로브 계 정량적 PCR (qPCR에)는, 전 사체 존재비를 측정하는 선호 방법이다. 프로브 기반 화학 다른 (염료 기반) 화학에 비해 최소한의 배경 형광을 제공합니다. 현재, 성적 증명서 풍부을 정량하는 그 사용 프로브 기반 화학 사용할 수있는 여러 가지 플랫폼이 있습니다. 96 웰 플레이트 (96) 그러나 qPCR에 샘플 또는 miRNA에 단지 최대 하나의 실행이 시험 될 수있는 가장 통상적으로 사용되는 방법이다. 샘플들의 다수 / miRNA가 분석되어야한다면 이는 시간 소모적이고 지루한 작업이다. 이러한 미세 유체 (예를 들면의 TaqMan 어레이 카드) 및 nanofluidics 배열 (예 : OpenArray) 제공 용이성 높은 처리량 프로브 기반 플랫폼은 재현하고 효율적으로 짧은 시간에 많은 수의 샘플에서 여러 마이크로 RNA의 풍요 로움을 감지한다. 여기서 우리는 실험 설정을 보여차 처리량의 증가 수준을 제공하는 프로브 기반 화학, 세 가지 서로 다른 플랫폼 (96 웰 플레이트, 미세 유체 및 nanofluidics 배열)를 사용하여 혈청 또는 혈장-EDTA 샘플에서 miRNA의 정량을위한 프로토콜입니다.
마이크로 RNA (miRNA가)는 유전자 발현 1-3 조정기로서 기능 ~ 22 뉴클레오티드 비 코딩 (NC)의 RNA. 동물의 대부분의 miRNA는 유전자 발현 2-4의 부정적인 규제에 이르게 3 'UTR을 대상으로, mRNA의 DNA 서열의 특정 염기 쌍을 통해 작동합니다. 이것은 일반적으로 mRNA의 번역의 억제를 통해 또는 리보솜 드롭 오프에 의해 발생합니다. 순환의 miRNAs는 당뇨병 5-7, 8, 난소, 전립선 및 유방암 구 (10,11), (12) B 형 간염 및 다른자가 면역 질환과 같은 질병 (13)의 다양한 연구 및 임상 분야에서 새로운 바이오 마커 인 것으로 밝혀졌다. 연구는 더 접근하고 9,11-15 덜 침습적 인 인간 혈장 및 혈청에서 순환뿐만 아니라 다른 세포 또는 조직에서의 miRNA 풍부한를 식별하기 위해 실시되었다.
miRNA의 정량화의 다른 방법은 전자되었습니다이러한 표준 96 웰 플레이트 플랫폼 4,12,16-18, 마이크로 유체 카드 플랫폼 12,18-23과 nanofluidics 어레이 플랫폼 17,24 등 여러 플랫폼을 사용하여에 stablished. 정량 실시간 PCR (qPCR에)는 여러 (염료 – 또는 프로브 기반) 화학 물질을 사용하여 성적의 상대 또는 절대 숫자를 측정 할 수있는 기능을 제공합니다. 프로브 기반 실시간 PCR 화학은 단일 전 사체를 검출하기 위해 복사본 낮은 배경 형광 및 높은 감도의 장점을 제공한다. 그것은 상대적으로 정량화 된 miRNA 발현 (25)를 결정하는 그것을 선호하는 방법을, 효과적인 사용이 간단하고 재현성이 높은 비용이다. 전사 (RT) 및 qPCR에 4,26,27 역 : 프로브 기반 qPCR의 방법은 일반적으로 두 단계를 포함한다. 줄기 루프 RT 프라이머 성숙한 또는 기본 miRNA의 분자에 하이브리드 및 보완 (C) DNA로 변환되는 경우 RT이다. cDNA의 생성물의 정량은 miRNA에 특이 PCR 프라이머를 사용하여 수행26 ~ 28. 프로브 기반 qPCR에의 원리는 형광 표지 된 프로브의 가수 분해를 포함 실시간으로 보완 가닥 확장의 검출을 기반으로합니다. 이 프로브는 형광 기자와 FRET (형광 공명 에너지 전송)을 할 수 있도록 단지 떨어져있는 거제를 포함하도록 설계되었습니다. 형광 기자 (에미 터)에서 방출의 검출은 소광 분자의 근접에 의해 마스크 처리됩니다. 을 Taq 폴리머 라제 (POL)가 상류 프라이머로부터 연장 및 포크 (프로브의 5 '말단)에 도달 할 때의 Taq의 POL 엑소 뉴 클레아 제 활성은 소광에서 형광 방출의 물리적 분리 / 분리 선도, 프로브 가수 분해한다. 형광 터의 단일 분자의 릴리스는 검출기에 의해 기록이 아니라 / 반응에서 형광 신호의 증분 증가로 제시됩니다. 형광의 증가는 정확한 숨어 있도록, 생성 된 PCR 산물의 양에 비례증폭 된 대상 (26, 28)의 antification.
정량화 된 miRNA의 수요 증가, 높은 처리량에 기술 매체는 더 많은 샘플을 짧은 시간 안에 처리 할 수 있도록 개발되었다. 저밀도의 TaqMan 어레이 (TLDA)은 하나의 플레이트에서 분석의 miRNA의 수의 증가를 제공하고 프로브 기반 qPCR의 화학에 기초하여 중간 처리량 마이크로 유체 혁신적인 디자인이다. TLDA는 cDNA의 합성에 사용되는 프라이머를 RT-소정 풀의 사용을 포함한다. 이러한 cDNA를 다음의 qPCR 22,26,29을 사용하여 여러 miRNAs의 발현을 결정하기 위해 사용자 정의 된 384 웰 미세 유체 카드에 방사된다. 카드의 각 웰 따라서 단일 TLDA 카드 (26)에서 처리 될 수있다 (384)의 반응까지, 특정의 miRNA (들)을 증폭하는 프라이머 및 프로브를 포함 건조.
nanofluidics 어레이 유전자 전 사체의 검출을 위해 사용되는 높은 처리량 플랫폼 <sup> 24 같은 프로브 기반 화학 제를 사용하여. 이 관통 구멍 스테인리스 슬라이드 (24)에 3,072의 배열로 33 나노 리터 반응 혼합물의 쉽게 로딩을 용이하게하기 위해 소수성 – 친수성 상호 작용을 제공하는 고유 행렬을 이용한다. 이 문서에서는 혈청 / 플라즈마에서의 miRNA를 정량화 이러한 방법이 수행하고 수행하고 이러한 데이터를 해석 할 때 고려해야 할 중요한 요소 방법을 시연에 초점을 맞추고 있습니다. 계정으로 연결, 개별 장점과 한계는이 문서에서 논의 될 것이다.
정확하고 재현성있는 결과를 얻기 위해 프로브 기반 qPCR의 프로토콜 내에서 중요한 단계는 RT-제품의 동일한 부피 및 농도는 각각 qPCR의 반응에로드되어) 있는지 일을한다, 2) 성분의 정확한 비율 및 볼륨에 필요한 qPCR의 반응은 제조 및 음, 3) 정확하고 일관된 볼륨 각각 qPCR의 반응에 첨가 혼합하고, 여전히 염두하면서 4) 각 샘플과 반응 혼합물의 제조 및 로딩, 가능한 한 짧은 시간에 완료된다 위의 중요한 단계는 앞에서 언급.
마이크로 유체 배열 카드는 적합한 원심 분리기 및 특정 버킷이 필요합니다. 각 버킷은 3 카드 (로드 / 빈)까지 저장할 수 있습니다. 항상 양동이의 3 슬롯을 점유하고 버킷 원심 분리기의 반대 슬롯에 비슷한 버킷 (이 양동이는 빈 또는 전체 중 3 카드를 포함한다) 배치로 균형되어 있는지 확인합니다. bucke에 카드를 배치하는 동안t 홀더, 8 저수지 위쪽으로 돌출 반응 우물이 원심 분리기의 외부 벽에 직면해야합니다. 실온에서 1 분 동안 331 XG에 카드 스핀. 제 1 스핀 후, 원심 분리기를 열고 시각적 반응 혼합물은 384 웰을 통해 분배 된 보장. 1 시간을 더 동일한 설정에서 스핀을 반복합니다. 양동이에서 카드를 제거하고 8 저수지의 각각에 반응 혼합물의 수준이 균일 있는지 확인하십시오. 저수지에 남아있는 액체 볼륨의 모든 불일치는 더 사용할 카드가 부적절합니다.
RT-생성물의 동일한 농도가, 동일한 입력 RNA의 농도는 각각의 RT 반응에 첨가된다. 전체 RNA의 농도는 마이크로 volumespectrophotometer를 사용하여 측정된다. 260/280 비율이 관찰 혈장 / 혈청으로부터 분리 RNA 1.3 정도로 낮을 수있다; 다운 스트림 qPCR에 관련 프로세스 나 데이터 (30)를 생성에이 효과가 나타나지 않습니다. 마찬가지로, 260/280의 비율여기에 테스트 RNA 샘플을 관찰 qPCR에에서 더 이상 효과를 1.3 ~ 1.7 사이에 있었다.
이러한 biofluids시 그러한 낮은 함량 RNA 샘플을 사용할 때, 처리에 앞서 RNA을 정량화하기 어렵다. 우리는 RNA 분리에서 합성 스파이크에서의 사용뿐만 아니라, 역전사 단계가 추천. 우리의 경험, 애기 장대의 miRNA 후보 (ATH-은 miR-159A와 ATH-은 miR-172A)에서 우리의 경험에 더있을 수 있습니다 (예 : CEL-은 miR-39 또는 CEL-은 miR-54) 예쁜 꼬마 선충의 miRNA가 선호된다 A.에서보다 동성 장대. 이러한 특정 스테이지에서 스파이크의 사용은 서로 다른 시간에 복수의 샘플 분석 miRNA에 걸쳐 데이터의 정규화를 설명 할 수있다. cDNA 합성 반응에 고정 된 RNA의 양을 입력하여도 32, 33을 권장한다.
miRNA의 정량화를위한 세 가지 프로브 기반 프로토콜은 여기에 설명 된 다양한 양을 필요로총 RNA 입력, 다른 워크 플로우 및 비용. 워크 플로우의 각 miRNA의 타겟의 수와 분석 할 샘플의 수에 따라 서로 다른 스루풋에 맞추도록 설계된다. 처리량이 증가 (384 RXN 3072 RXN RXN 96)을, 반응 당 비용은 단위 시간에 걸쳐 얻어진 데이터의 양이 증가함에 따라 감소한다. 이러한 플랫폼 모두의 TaqMan 화학을 이용하기 때문에, 얻어진 데이터의 품질이 유사 할 것으로 예상 할 수있다. 의 TaqMan qPCR에 혈청 / 혈장 9,11,27에서의 miRNA의 풍부를 식별하기위한 잘 확립 된 방법이다. 여기서 설명하는 세 가지 플랫폼이 동일한 화학을 공유하지만, 반응 부피의 감소는 전 사체의 동적 검출 범위의 감소 (파르 RJ 외., 미발표)로 이끈다. 96 웰 qPCR의 플랫폼은 낮은 처리량,하지만 고감도 플랫폼이며, 우리의 관점에서, 모든 프로브 기반 (또는 기반 염료) PCR 플랫폼의 "황금 표준". 그러나,이 월샘플의 수백 또는 수천 분석 및 여러 마이크로 RNA에 대한되는 경우 가장 경제적 또는 효율적인 플랫폼을 수 없습니다. 미세 유체 (TLDA)과 nanofluidics은 (OA) 플랫폼은 짧은 시간에 큰 데이터의 수집을 할 수 있도록 설계 높은 처리량 / 콘텐츠 플랫폼이다. 일괄 차이 TLDA 카드에서 관찰되었지만,이 같은 배치에서 TLDA 카드를 요청함으로써 최소화 될 수있다. 낮은 풍요의 miRNA를 TLDA 카드의 다른 배치에 동일한 샘플을 사용하여 테스트 할 때 – 우리는 TLDA 플랫폼 (그림 3) 중간의 17 %에 상당한 변화를 보여 주었다 관찰합니다. 따라서 우리는 TLDA 카드를 사용하여 분석을 위해 동일한 배치 번호를 사용하는 것이 좋습니다. 이 변화는 또한 잠재적 인로드 및 피펫 오류를 포함하여 기술 변화로 인해 수 있습니다. 그러나, 우리는 TLDA 카드의 동일한 배치를 요청 / 주문을 추천합니다. 유의 배치 변화는 OA 플랫폼에서 관찰되지 않았다. 그럼에도 불구하고,의 TaqMan experimen을 기반으로탈 qPCR의 혈장 / 혈청에서의 miRNA의 풍부를 측정하기 위해 제공 쉽게 접근한다. 여기서 설명 낮은, 중간 및 높은 처리량 접근법은 고도로 효율적이고 재현하고 깨끗한 (낮은 배경 잡음) 화학 제를 사용하여 샘플의 miRNAs의 범위를 분석 할 수있는 유연성을 제공한다.
The authors have nothing to disclose.
모든 저자는 NHMRC CTC, 시드니, 청소년 당뇨병 연구 재단 (JDRF), 호주의 대학과 레베카 쿠퍼 재단, 호주에서 인프라 지원을 인정합니다. 이 연구는 WW, RJF을 아하기 위해 호주 연구 협의회 (FT110100254)와 JDRF, 호주 (CRN201314)에서 보조금을 통해 자금을 지원하고 MVJ 모든 젖은 실험실 실험을 실시, ASJ 데이터 분석을 수행 하였다. WW는 첫 번째 초안을 썼다. AAH는 연구를 계획하고 데이터를 분석했다. 모든 저자 읽고 게시를 위해 제출 된 원고, 그림 및 워크 시트의 최종 버전에 동의했다.
96 well-platform | |||
For Reverse transcription | |||
TaqMan MicroRNA Assays INV SM | Applied Biosystems |
4427975 | https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer. |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems |
4366597 or 4366596 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray. |
For qPCR run on a 96-well platform | |||
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystems |
4367846 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA. |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346907 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product |
Microfluidics platform (TLDA) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399966 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444281 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
OR | OR | ||
Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 | Applied Biosystems |
4444750 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
For Pre-amplification | |||
TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems |
4391128 or 4488593 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 | Applied Biosystems |
4444303 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 | Applied Biosystems |
4399233 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
1X TE Buffer (100 mL) | Invitrogen | 12090-015 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray. |
To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card | |||
TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913 |
Nanofluidics platform (OpenArray) | |||
For Reverse transcription | |||
Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above). | |||
For Pre-amplification | |||
Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above) | |||
To load and run the slides | |||
TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel) | Applied Biosystems |
4470187 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187 |
QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit | Applied Biosystems |
4469576 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576 |
OpenArray 384-well Sample Plates | Applied Biosystems |
4406947 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947 |
TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix | Applied Biosystems |
4462159 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159 |
OpenArray AccuFill System Tips | Applied Biosystems |
4457246 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246 |
Others | |||
Nuclease-Free Water | Qiagen | 129117 | http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water |