Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.
Telomerer dysfunksjon-indusert tap av genomet integritet og tilhørende DNA skade signale og sjekkpunkt svar er veletablerte sjåfører som forårsaker vev degenerasjon under aldring. Kreft, med insidensrater sterkt økende med alder, er preget av korte telomere lengder og høy telomerase aktivitet. Å studere rollene telomere dysfunksjon og telomerase reaktivering i aldring og kreft, viser protokollen hvordan å generere to murine induserbar telomerase knock-in alleler 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible tert-Østrogen reseptor (mTERT-ER) og Lox propp-Lox TERT (LSL-mTERT). Protokollen beskriver prosedyrer for å indusere telomerer dysfunksjon og aktivere telomerase aktivitet i mTERT-ER og LSL-mTERT mus in vivo. De representative data viser at reaktivering av telomerase aktivitet kan bøte vev degenerative fenotyper indusert av telomerer dysfunksjon. I order å bestemme virkningen av telomerase reaktive på tumorgenese, genererte vi prostatatumormodell G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L og thymus T-cellelymfom modell G4 Atm – / – mTERT ER / ER . De representative data viser at telomerase reaktive på bakgrunn av genomisk ustabilitet indusert av telomerer dysfunksjon i stor grad kan forbedre tumorigenesis. Protokollen beskriver også fremgangsmåten som benyttes for å isolere neurale stamceller (NSC) fra mTERT-ER og LSL-mTERT mus og aktivere telomerase-aktivitet i NSCs in vitro. De representative data viser at reaktivering av telomerase kan forbedre selvfornyelse evne og nevrogenesen in vitro. Til slutt beskriver protokollen prosedyrene for å utføre telomere FISH (Fluorescens In Situ Hybridisering) på både mus FFPE (Formalin Faste og Parafinefinn Embedded) hjernevev og metafase kromosomer dyrkede celler.
Telomerase er et enzym som er ansvarlig for å opprettholde telomerer. Dette er repeterende sekvenser i endene av kromosomene som beskytter deres integritet. De viktigste komponentene i telomerase holoenzyme er en reverstranskriptase katalytisk subenhet (tert) og en RNA subenhet (TERC) som fungerer som mal for å legge til telomeric gjentar 1,2. Mens generelt trykkes i differensierte somatiske celler, utviser telomerase robust aktivitet og spiller viktige roller i kjønnsceller, kreftceller og stamceller.
mTERC og mTERT knockout mus gir stor in vivo modellsystemer for å studere funksjoner av telomerase i både stamceller og kreft. Den mTERC og mTERT knockout mus (G1) viste ingen åpen fenotyper grunn av den lange reserve av telomerer i mus tre. Men serielt intercrossing mTERC og mTERT knockout mus til sent generasjon (G5-G6) resulterte iprogressiv erosjon av telomerer og til slutt provosert alvorlig degenerasjon av svært proliferative vev 4. Late generasjon (G5-G6) mTERC – / – mus er infertile på grunn av høy forekomst av apoptose i testikkel og bakterie celle uttømming. G5-G6 mTERC – / – mus også vise degenerative fenotyper i svært proliferative vev inkludert benmargen, tarm og hud på grunn av høy forekomst av apoptose og defekt selvfornyelse evne i vev stilk / progenitor cellekamre 4. Blodkreft stamceller i benmargen av sen generasjon mTERC – / – mus utstillings tap av proliferativ potensial, kompromittert selvfornyelse evne, økt apoptose og, til slutt funksjonell utmattelse 5,6. På samme måte ble gradvis økt apoptotiske legemer i tarm krypter observert i hver suksessiv generering av G1-G6 mTERC – / – mus 7,8. THan skadelig virkning av dysfunksjonelle telomerer synes ikke å være begrenset til høye omsetnings vev ettersom både proliferasjon av voksne neurale stamceller in vitro og in vivo nevrogenesen ble alvorlig nedsatt i slutten av generasjonen (G4-G5) mTERC – / – mus 9 . Rollen til telomerase i stamceller er videre støttet av funnene i en sjelden menneskelig genetisk lidelse dyskeratosis congenita (DKC), som på noen måter ligner tidlig aldring 10,11. DKC er forårsaket av mutasjoner i TERC, tert, og gener som koder dyskerin, en kjerne telomerase subenhet, og andre dyskerin tilhørende proteiner 12. I gjennomsnitt, telomerer i DKC pasienter er kortere enn 99% av alders matchet kontroller. Den store sykelighet av sykdommen skyldes aplastisk anemi, som er forårsaket av defekt vedlikehold av hematopoetiske stamceller. Andre aspekter av sykdommen som for eksempel oral leukoplaki, spiker dystrofi, mentale retardatipå, testiklene atrofi og lungekomplikasjoner alle foreslår svekket funksjoner av vev stamceller og stamceller 10, funn i nært samsvar med de i slutten av generasjonen av telomerase knockout mus. DKC pasienter er utsatt for myelodysplastisk syndrom og har en økt forekomst av maligne slimhinne svulster. Dermed mangel av telomerase i humane pasienter rekapitulerer defekter i stamcelle funksjoner og tumor predisposisjon som er observert i slutten generasjon telomerase knockout mus.
Korte telomerer og høy telomerase aktivitet er kjennetegnene ved kreft. Som normale eller premaligne celler deler, lav eller fraværende telomerase aktivitet fører til eventuell erosjon av telomerer og aktivering av cellulære sjekkpunkter som ligner de provosert av DNA dobbel-strandet-pauser (DSB sin) 13. Som klassisk DSB, har telomere dysfunksjon vist å indusere p53 og tilhørende cellulære responser, så som begynnende alderdom og / eller apoptosis 14,15. Ved mutasjonsinaktivering av p53, er celle sykling og celle overlevelse forbedret i celler med telomere dysfunksjon, som gir en pro-kreftfremkallende mutasjons mekanisme preget av translokasjoner og regionale presiseringer og slettinger 16,17. Samtidig fort telomere dysfunksjon og tilhørende utbredt kromosomal ustabilitet (selv i p53 null-celler) ser ut til å begrense fulle ondartet progresjon av slike kreftformer. For eksempel, sent generasjon G4-G5 mTERC – / – Ink4a / Arf – / – mus viste signifikant redusert lymfom forekomsten sammenlignet med Ink4a / Arf null mus på grunn av telomerer avgang. I en annen studie, mer avanserte adenomatøse lesjoner i G4 mTERT – / – APC min mus ble sterkt undertrykt i sammenligning med APC min mus på grunn av betydelig vekst og apoptose 18,19. Denobservasjon at telomere dysfunksjon-indusert genomisk instabilitet hemmer tumorprogresjon ber spekulasjoner om at aktiveringen av telomerase kan mulig ondartet progresjon delvis av quelling genomisk instabilitet til et nivå som er kompatibelt med kreft cellelevedyktigheten og / eller nøytraliserende p53-avhengig eller sjekkpunkt-uavhengig mekanismer.
For å undersøke om telomerase reaktive kan stoppe eller reversere aldring av stamceller, og om telomerase reaktive kan fremme tumorigenesis mot et bakteppe av genomisk ustabilitet, genererte vi to induserbare murine telomerase alleler. Den første er 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible tert-Østrogen reseptor (mTERT-ER) fusjon knock-in allel. I fravær av 4-OHT, mus homozygote for mTERT-ER (utpekt mTERT ER / ER) er telomerase aktivitet mangelfull og opprettholde samme cytogenetiske og cellulære fenotyper som konvensjonell mTERT eller mTERC knockout modell. Ved 4-OHT behandling, kan tert-ER protein aktivitet gjenopprettes til nivåer kan sammenlignes med den innfødte TERT protein 20, 21. Den andre allelet er en roman induserbar TERT knock-in-allelet som inneholder en intronic loxP-Stopper-loxP kassett (LSL- mTERT); upon Cre-mediert eksisjon av LSL, mTERT er re-uttrykt under endogen uttrykk kontrollmekanismer 22.
Her rapporterer vi generering av to induserbare murine telomerase alleler og hvordan å aktivere telomerase in vivo og in vitro. Den avgjørende skritt for å reaktivere mTERT-ER aktivitet er å holde en kontinuerlig konsentrasjon av tamoxifen, så vi velger å bruke fire-OHT tid-release pellets produsert av innovativ forskning of America. Pellets holde slippe 4OHT på en steady state blodnivå av en ng / ml for opp til 60 dager. I en tidligere studie, viste vi at reaktivere telomerase aktivitet med denne strategien var i stand til å forbedre de degenerative fenotyper som stamcelle utmattelse, svekket vev skader svar og organsvikt i flere organer som ble indusert av telomerer dysfunksjon i G4 mTERT ER / ER mus 20.
Annet enn å studere funksjonen av telomerase i aldring, kan disse to induserbare telomerase alleler også brukes til å studere kreft. Tidligere studier toknytte av disse allelene for å undersøke hvilken rolle telomerer avgang og telomerase reaktivering i utformingen av genomer og påvirker biologien til T-celle thymic lymfom 21 og prostatakreft 22. Disse to studiene viste at telomerer dysfunksjon i slutten generasjon G4 Atm – / – mTERT ER / ER og G4 PB-Cre4 PTEN L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L mus gir en mekanisme fyre oppkjøpet av tidlige mutagene hendelser for startfasen, men hindre progresjon av fullt ondartede svulster. Når telomerase ble reaktivert i sammenheng med telomere dysfunksjon-indusert genomisk instabilitet, DNA-skadekontrollpunkter og utbredt kromosomal ustabilitet ble undertrykket, som tillater den fulle utviklingen av ondartede svulster med nye biologiske egenskaper som ben-metastase av prostatakreft 21 og hjerne infiltrasjon av thymusc lymfom 21. Lignende fenomener ble også observert i andre krefttyper, inkludert tykktarmskreft og kreft i bukspyttkjertelen (personlig kommunikasjon med legene. Haoqiang Ying, Adam Boutin og Ronald DePinho).
Fordi TERT-ER-protein lett kan veksles mellom på og av tilstander, avhengig av om dyrene blir behandlet med tamoxifen eller kjøretøy, kan tumormodeller generert av mTERT-ER-allelet anvendes for å teste anti-telomerase terapi. I forrige undersøkelse, svulster generert i G4 Atm – / – mTERT ER / ER dyr ble løslatt fra 4-OHT; på telomerase utarming, svulster slutt krympet på grunn av gjeninnføringen av telomere dysfunksjon-indusert sjekkpunkter 21. Men noen av tumorene ervervet resistens i respons til telomerase utryddelse ved å aktivere en alternativ Forlengelse av Telomerer (ALT) mekanisme. Ytterligere karakterisering av disse ALT + resistente svulster viste at tHei har avvikende transkripsjon av gener involvert i mitokondrie biologi og oksidativt forsvar inkludert en master regulator av mitokondrie syntese og oksidativt forsvar PGC-1β. Knockdown av PGC-1β eller SOD2 (en annen regulator av oksidative forsvar) betydelig eliminerer ALT + kreftceller mens holde telomerase + kreftceller forblir relativt intakt 21.
En begrensning av disse to knock-in alleler er at de bare har råd til reaktivering av telomerase på endogent nivå, fordi de er i mors locus av telomerase genet. I de fleste humane cancere, er telomerase faktisk overuttrykt på et mye høyere nivå. For å øke nivået av telomerase, en modifikasjon vi kan vurdere er å sette inn mTERT-ER konstruere med en sterkere promoter som PGK (fosfoglyceratkinase) promoter inn Rosa26 locus.
I konklusjonen, disse to nye induserbare murine telomerase alleler gir enestående genetic verktøy for å studere funksjoner av telomerase i aldring og vev homeostase samt tumorprogresjon, spesielt under bakgrunn av forhånds ervervet telomere dysfunksjon-indusert genomisk instabilitet. Den mTERT-ER-allel kan også brukes til å studere anti-telomerase terapi ved å krysse inn i andre tumor utsatt musemodeller.
The authors have nothing to disclose.
J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).
Leica AM6000 Micromanipulation Kit | Leica | Per quote | |
Leica DMI6000 B inverted microscope | Leica | Per quote | |
Neomycin | Life technologies | 21810031 | |
isoflurane vaporizer | Veterinary Anesthesia Systems | 911103 | |
isoflurane | Henry Schein | 1005796 | |
ketamine-xylazine mixture | Sigma-Aldrich | K113-10ML | |
4-OHT powder | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
Tamoxfien | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
4-OHT pellet | Innovative Research of America | Custermized | |
Precision Trochar (10 Gauge) | Innovative Research of America | MP-182 | |
wound clip applier | Fischer Scientific | 01-804 | |
clip | Fischer Scientific | 01-804-5 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
HBSS | Life technologies | 14025092 | |
PBS | Life technologies | 10010023 | |
xylene | Fischer Scientific | X3P-1GAL | |
methanol | Fischer Scientific | A-433S4 | |
acetic acid | Fischer Scientific | A38-500 | |
ethanol | Fischer Scientific | 22-032-104 | |
formamide | Fischer Scientific | F84-1 | |
PNA telomere probe | Panagene | F1001-5 | |
PNA centromere probe | Panagene | F3003-5 | |
20X SSC | Fischer Scientific | BP1325-4 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A2153-10G | |
tRNA | Sigma-Aldrich | R5636-1ML | |
Tween 20 | Fischer Scientific | BP337-100 | |
rubber cement | Walmart | Elmer's | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |